酶法ELISA试剂盒操作步骤

日期：2024-11-22 00:12

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摘要：一、试验原理酶法试剂盒（ELISA）试验原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体外表，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保存其免疫活性，又保存酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的过程与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗刷的办法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与其他物质分开，终究结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的份额。参加酶反响的底物后，底物被酶催化变为有色产品，产品的量与标...

一、试验原理

酶法ELISA试剂盒试验原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体外表，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保存其免疫活性，又保存酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的过程与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗刷的办法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与其他物质分开，终究结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的份额。参加酶反响的底物后，底物被酶催化变为有色产品，产品的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据色彩反响的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可ji大地地放大反响作用，从而使测定办法到达很高的敏感度。

二、酶法ELISA试剂盒操作过程

1.ELISA在操作前试剂和组分都先康复到室温，规范品、质控品和样品，主张做复孔。按前面试剂预备中描述的办法，配制好试剂盒各种组分的工作液。从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

2.设置规范品孔、样本孔和空白孔，规范品孔各加不同浓度的规范品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。除空白孔外，规范品孔和样本孔，参加辣根过氧化物酶符号的检测抗体100μL。用封板膜盖住反响板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

3.温育好后揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗刷液，静置20s，甩去洗刷液，吸水纸上拍干。如此重复4次（共洗板5次）。若使用主动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，增加浸泡20s的程序，可以进步检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充沛拍干反响板。洗刷在ELISA过程中虽不是一个反响过程，但却决议着试验的胜败。ELSIA就是靠洗刷来到达别离游离的和结合的酶符号物的意图。经过洗刷以铲除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的搅扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗刷时应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。可以说在ELISA 操作中，洗刷是主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗刷，不得马虎。

4.洗板好后将底物A和B按1:1体积充沛混合，所有孔中参加底物混合液100μL。用封板膜盖住反响板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。所有孔参加停止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

5.检测完成后，以规范品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用核算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创立规范曲线方程，经过样本的吸光度（OD值），利用方程核算样品的浓度值。如果样品被稀释，经过上述办法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终究浓度。

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