蛋白电泳流程:
1、组装SDS-PAGE:将配制好的SDS-PAGE胶组装在Western-Blotting电泳系统中(注意厚玻璃板稍高、靠外放置,薄玻璃板稍矮、靠内放置,水平放置时厚板在下、薄板在上记为正面);
2、蛋白上样:加入电泳缓冲液,每孔上样量为10-20 μL(蛋白总量10-20ug即可),蛋白marker上样3-5 μL(注意保证上样体积尽量一致,否则可能导致蛋白条带不在同一水平线;上样时可用10 μL移液器缓慢滴加,切忌快速吹打以免引起蛋白样品溢出,此外,上样体积好不要接近上样孔的总体积,笔者经验10孔板每孔上样体积不宜超过40 μL,15孔板上样体积不宜超过25 μL;当然,上样孔的总体积大于上述数值);
3、接通电源、开始电泳:80 V电泳50 min,待蛋白marker到达分离胶改用120 V电泳2 h至蛋白marker到达分离胶底部,停止电泳(电泳参数不同实验室习惯不一,也可一段式即无需调整电压;大多数实验室多采用两段式:低电压80V左右缓慢电泳压平样品,稍高电压120V左右快速分离分子量不同的蛋白);
tips:一般来说电泳液 好现配现用,方便纠错;但是大多数研究者的经验式,电泳液可反复使用,内槽一般选用新鲜电泳液,外槽可选用回收电泳液,外槽电泳液高度一般无特殊要求,有的研究者习惯外槽电泳液高度显著低于内槽电泳液高度,造成所谓“电势差”,笔者经验这种电势差对电泳时间和WB结果无明显影响;此外,有研究者会疑惑电泳液可重复使用多少次,笔者经验是n次,n≥10,均不影响实验结果。