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聚合酶链式反应(PCR)技术标准过程

PCR全称为聚合酶链式反应,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。

标准的PCR过程分为三步:

第1步,DNA变性(90℃-96℃)双链DNA在高温作用下,氢键断裂,形成单链DNA。

模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

第2步,退火(60℃-65℃)温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

第3步,延伸(70℃-75℃)在Taq酶的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′到3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。

DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。