兔小肠平滑肌细胞

公司来源可靠（源于ATCC、ECACC、DSMZ、JCRB等知名品牌），活力>95%，贴壁性好。我们从试剂、包被器皿、冻存原代细胞、新鲜原代细胞、原代细胞的分子学实验等提供全程服务。我司拥有专业的实验室，可无菌操作并提供相关科研项目解决方案以及实验服务。

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

培养方法：

收到人胚肺成纤维细胞；MRC-5说明书后，在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满（达80-90%）。即可进行传代，具体步骤如下：

a，弃去培养液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶内加入1.0-2.0ml胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，吸取胰蛋白酶，加含有6ml 含10%血清的培养液，轻轻吹打细胞。

c，加入等量的的培养液，轻轻吹打混匀后吸出一半，分到新的培养

d，传代比例：1:2-1:3

培养操作：

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

IL-24 / MDA-7 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

CD164 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

CD164 抗體, 鼠單抗 ELISA   IHC-P  FCM    50 µg

CD164 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

CD82 / KAI-1 抗體, 鼠單抗 IHC-P    50 µg

CLIC4 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA   WB   IP   50 µg

K-Ras 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

CD300A 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

CD300A 抗體, 兔多抗 ELISA    400 µg

CD300A 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

CD300A 抗體 (FITC), 鼠單抗 FCM    25 Test

LMAN2 / VIP36 抗體, 鼠單抗 ELISA   WB   IP   50 µg

PHPT1 抗體, 兔單抗 IHC-P   FCM   IF  ICC/IF    50 µg

DUSP14 / MKP-6 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 µg

CD300A 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

CD300A 抗體, 鼠單抗 FCM    50 µg

CALML3 抗體, 兔單抗 ELISA    50 µg

CALML3 抗體, 兔多抗 ELISA    400 µg

CALML3 抗體, 鼠單抗 FCM   IF   ICC/IF   50 µg

成纤维细胞生长因子 FGF fibroblast growth factor 25 800 pg/mL 1

成纤维细胞生长因子10 FGF-10 fibroblast growth factor-10 7.5 240 pg/mL 1

成纤维细胞生长因子19 FGF-19 fibroblast growth factor-19 7.5 240 pg/mL 1

成纤维细胞生长因子21 FGF-21 fibroblast growth factor-21 7.5 240 pg/mL 1

成纤维细胞生长因子23 FGF-23 fibroblast growth factor-23 12.5 400 pg/mL 1

程序性死亡分子-1 PD-1 programmed death-1 7.5 240 pg/mL 1

程序性死亡配体-1 PDL1 programmed death Ligand 1 15 480 pg/mL 1

穿孔蛋白1 PRF1 Perforin 1 15 480 pg/mL 1

垂草扁桃酸 VMA Vanillylmandelic Acid 7.5 240 ng/mL 1

垂体中叶素 IMD Intermedin 10 320 pg/mL 1

雌二醇 E2 Estradiol 15.625 500 pg/mL 1

雌 E estrogen 7.5 240 pg/mL 1

雌素受体 ER Estrogen Receptor 6.25 200 pg/mL 1

雌R Estrogen Receptor 2 64 pg/mL 0.1

红细胞**素 EPO Erythropoietin 0.75 24 mIU/mL 0.1

促红细胞**素抗体 EPO-Ab Erythropoietin antibody 1.5 48 IU/L 0.1

促红细胞**素受体 EPOR Erythropoietin receptor 1.5 48 ng/mL 0.1

促黄H luteotropic hormone 1.25 40 mIU/mL 0.1

促甲状腺体抗体 TSHR Ab thyroid-stimulating hormone receptor antibody 0.125 4 IU/L 0.1

促甲状腺素 TSH Thyroid Stimulating Hormone 0.375 12 mU/L 0.1

促甲状腺素释放H thyrotropin-releasing hormone 2.5 80 pg/mL 0.1

促卵泡素 FSH Follicle-stimulating hormone 0.5 16 mIU/mL 0.1

促肾上腺皮质 CRH corticotropin releasing hormone 2.5 80 pg/mL 0.1

促肾上腺皮质H adrencocorticotropic hormone 2.5 80 pg/mL 0.1

兔小肠平滑肌细胞促肾上腺皮质因子 CRF corticotropin-releasing factor 12.5 400 pg/mL 1

促生长0 pg/mL 1

操作流程：

1.1主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。

1.2 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：

1.2.1 细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。

1.2.2 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。

1.3 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。

1.4 细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。

1.5 细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。 

1.6 生长曲线 取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。

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