兔**内膜间质细胞

培养方法

传代方法 将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5mL，移至培养箱消化，约2min取出。传代用12mL CM1-1培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3~6皿培养；

生长条件 37℃，5%CO2，CM1-1培养液。CM1-1培养液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培养液，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠。

存储条件 冻存则用6mL冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存，过夜转移至液氮中保存。

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培养操作步骤 ：

1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中； 

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及细胞化学检测。 

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

L-Trptophan L-色氨黄芪甲苷顺-二双(三乙基膦)铂(II)MLC/Myosin light chain 3 peptide  肌球蛋白轻链3抗原
L-Trptophan L-色氨黄芪皂苷Ⅰ异烟乙酯MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor)  巨噬移动抑制因子抗原
L-Arabinose L-阿拉伯糖黄芪皂苷Ⅱ异烟乙酯MIP-1 Beta (macrophage inflammatory protein 1 Beta)  巨噬炎症因子1β 抗原
Malt Extract 麦芽提取物黄芪皂苷Ⅲ2-乙基-3-甲基吡CD122/IL-2RB(Imterleukm-2 Receptor beta)  CD122/白介素2受体β链抗原
学(LP0005)丁香酚2-乙基-3-甲基吡MIP2 (myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 2)  巨噬炎症蛋白2抗原
学明胶 (LP0008)黄杨（环维黄杨星D）甲基二乙氧基膦MMP-13 (Matrix metalloproteinase 13)  基质金属蛋白酶13抗原
琼脂（1 号琼脂）Agar Bacteriological(Agar )红景天苷甲基二乙氧基膦MMP-20(matrix metalloproteinase 20)  基质金属蛋白酶20抗原
技术琼脂 (3号琼脂) (LP0013)rosarin3-氨基-4-羟基苯甲MMP-17(Matrix metalloproteinase-17)  基质金属蛋白酶-17抗原
肝脱水物学）（Liver Desiccated Bacteriological）络塞维3-氨基-4-羟基苯甲MMP-26(Matrix metalloproteinase-26)  基质金属蛋白酶-26抗原
中性肝消化物（Liver Digest Neutralised）rosin3-氨基-4-羟基苯甲MMP-9(matrix metalloproteinase 9)  基质金属蛋白酶-9抗原
高纯度琼脂(Purified Agar)rosiridin4,4'-(1-苯乙基)双酚MMP-10(matrix metalloproteinase 10)  基质金属蛋白酶-10抗原
Peptone Bacteriological Neutralised 中性**学蛋白胨槐果4,4'-(1-苯乙基)双酚MPO peptide  髓过氧化物酶抗原
Peptone MycologicaL 蛋白胨花旗松素（二氢槲皮素）4,4'-(1-苯乙基)双酚MRP2 (multidrug resistance-associated protein2)  多药耐药相关蛋白2
Casein Hydrolysate（Acid）/酪蛋白水解物（解) 现货槲皮素波生坦(水合物)MRP5/ABCC5(Multidrug Resistanec-Associated Protein 5)  多药耐药相关蛋白5抗原
胰蛋白胨T（Tryptone T）槲皮苷2-基乙酯MrpL28 (mitochondrial ribosomal protein L28)  线粒体核糖体蛋白L28(抗原)
中性大豆蛋白胨（Soya Peptone Neutralised）蒿甲顺-双(2,2-二吡基)二化钌(II)二水合物MLH1(Mutl homolog l gene)  错配修复蛋白1抗原
胰蛋白示（Trytose）姜黄素草铈(III)水合物, REactonMUC5AC/Mucin 5AC(Gastric Mucin M1)  胃粘液素抗原
乳清蛋白水解物（Lactalbumin Hydrolysate）去甲氧基姜黄素草铈(III)水合物, REactonMTNR1B/MTNR-1B(Melatonin receptor 1B)  褪黑素受体1B抗原
Peptone P 蛋白胨P双去氧基姜黄素4-溴邻苯二胺MLN(Motilin)peptide  胃动素多肽
胆盐(Bile Salts)莪术(姜黄)4-溴邻苯二胺mTOR(Mammalian target of rapamycin)  雷帕霉素靶蛋白
3 号胆盐(Bile Salts No.3)金丝桃苷5-戊酰Muc-1/CD227  粘蛋白-1/上皮膜
乳糖（用） Lactose Bacteriological金丝桃素5-戊酰MyD88 (myeloid differential protein-88)  髓样分化蛋白抗原
兔**内膜间质细胞葡萄糖 (LP0071)绞股蓝皂苷5-戊酰PMP2/FABP8(peripheral myelin protein 2)  周围神经髓鞘蛋白2抗原
Peptone Special 特殊蛋白胨苦杏仁苷2-甲基-4-戊烯MYSM1(Myb-like, SWIRM and MPN domain-containing protein 1)  MYSM1抗原

实验要点及说明：

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 

2．所使用的盖玻片应该为玻璃**，并经过铬酸洗液处理； 

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

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