兔T**细胞

培养方法

传代方法 将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5mL，移至培养箱消化，约2min取出。传代用12mL CM1-1培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3~6皿培养；

生长条件 37℃，5%CO2，CM1-1培养液。CM1-1培养液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培养液，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠。

存储条件 冻存则用6mL冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存，过夜转移至液氮中保存。

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培养操作步骤 ：

1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 

4．将��过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中； 

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及细胞化学检测。 

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

优级胎牛血清 绿原1-溴-2,3,5,6-四苯JAK2(Tyrosine-protein kinase JAK2; Janus kinase 2; JAK-2)  蛋白质酪氨激酶JAK-2抗原
新绿原（5-咖啡酰奎宁）1-溴-2,3,5,6-四苯phospho JAK2(phospho-Tyr1007+Tyr1008)  磷化蛋白酪氨激酶JAK-2抗原
ES级别胎牛血清隐绿原（4-咖啡酰奎宁）5-溴-2-JNK1/3 (c-Jun amino-terminal kinase 1/3)  c-Jun氨基末端激酶1/3多肽抗原
新生牛血清异绿原A（3,5-二咖啡酰奎宁）顺-二双(三苯基膦)铂(II), Pt minphospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185) peptide  磷化氨基末端激酶1/2/3（pJNK1/2/3）抗原
异绿原B（3,4-二咖啡酰奎宁）顺-二双(三苯基膦)铂(II), Pt minKi-67(Antigen identified by monoclonal antibody Ki 67)  Ki-67 Antigen
马血清异绿原C（4,5-二咖啡酰奎宁）烯基三苯基溴化磷Klf4 (Kruppel likefactor 4)  肠道内富含的Kruppel样因子抗原
1-咖啡酰奎宁烯基三苯基溴化磷phospho-KLF5/Krueppel-like factor 5 (pSer272)  磷化肠道内富含的Kruppel样因子5抗原
热灭活马血清洋蓟素（1,3-二咖啡酰奎宁）苯酚三水合物phospho-Klf5/CKLF/Kruppel like factor 5, Human, mo, rat, horse, bovine, rabbit, pig, dog  磷化肠道内富含的Kruppel样因子5抗原
1,5-二咖啡酰奎宁苯酚三水合物LDH(Lactate Dehydrogenase)  乳脱氢酶抗原
山羊血清巴马汀（黄藤素，棕榈）顺-二(苯甲)二铂(II)Leptin receptor  瘦素受体
橙皮苷2-羟基乙基磺PAFAH2/Lp-PLA2/PLA2G7(plaet-activating factor acetylhydrolase 2)  脂蛋白磷脂酶A2抗原
菌显色培养基新橙皮苷2-羟基乙基磺Lgr5/GPR49  肠上皮干蛋白（多肽）
柴胡皂苷B2-羟基乙基磺LH(Luteinizing Hormone)  促黄体**素抗原
定位显色培养基橙皮素[1,3-双(二苯基膦)烷]二化镍(II)LH(Luteinizing Hormone)  人促黄体**素(多肽)
穿心莲内酯[1,3-双(二苯基膦)烷]二化镍(II)LH/CG Receptor(Luteinizing Hormone/Choriogonadotropin Receptor)  人促黄体**素受体抗原
大肠杆菌显色培养基甘草六磷(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷L-HDC (L-Histidine decarboxylase)  L-组氨脱羧酶抗原
甘草次六磷(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷LIF peptide  白血病抑制因子抗原
ECC显色培养基甘草单铵盐六磷(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷LIFR/CD118 peptide  白血病抑制因子受体抗原
甘草苷六磷7-氮杂苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(AOP)Lingo-1  Nogo受体作用蛋白抗原
O157显色培养基异甘草苷六磷7-氮杂苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(AOP)LIS1(Lissencephaly-1 protein)  无脑回的致病基因LIS1抗原
兔T**细胞甘草素/甘草三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二)钇(III)LFABP/FABP-1(Liver Fatty acid binding protein)  肝脏型脂肪结合蛋白抗原
O157显色培养基（改进型）大黄9-溴蒽LFABP/FABP-2(Liver Fatty acid binding protein)  肝脏型脂肪结合蛋白抗原
O104显色培养基大黄素9-溴蒽LN (laminin)  层粘连蛋白(多肽抗原)
金黄色葡萄球菌显色培养基大黄素甲9-溴蒽Laminin Beta1 peptide  层粘连蛋白β1抗原

实验要点及说明：

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 

2．所使用的盖玻片应该为玻璃**，并经过铬酸洗液处理； 

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

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