大鼠**内膜间质细胞

细胞培养的优点：

1.研究的对象是活细胞

在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。

2.研究条件可以人为控制

pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以���于严格控制之下。

3.研究的样本可以达到比较均一性

通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。

4.研究内容便于观察、检测和记录

采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。

培养操作：

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.

细胞处理方法：

以下细胞处理方法及细胞说明书仅供参考，具体操作还需要根据到货时细胞密度，细胞生长状态等具体情况，酌情处理，如需要更详细技术指导。

一．贴壁细胞

客户接收到细胞，用75%的酒精（建议配制75%酒精的水是过的）培养瓶外部。

肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X ,200X 各一张）。

显微镜观察细胞，当细胞融汇至80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。

严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。

用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶，37℃,5%CO2  培养。

二．悬浮细胞

1. 接收到细胞，用75%的酒精（建议配制75%酒精的水是过的）培养瓶外部。

2. 肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X ,200X 各一张）。

3. 严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

4. 将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒）。

5. 1000rpm,5min离心，重悬细胞。 换新的细胞培养瓶和新鲜培养基，37℃,5%CO2培养。

冷冻保存细胞之方法

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

胰酶-EDTA，（10X）
0. 5%胰酶，EDTA。4Na人间充质干-骨髓微RNA三苯基膦化钌IL-23R(Interleukin-23 receptor)  白介素-23受体抗原
胰酶-EDTA，
0.25%胰酶，EDTA。4Na人间充质干-脂肪微RNA三苯基膦化钌IL-1 Alpha (Interleukin-1 Alpha )  白介素1α抗原
人间充质干-肝脏微RNA三苯基膦化钌IL-2 (Interleukin-2)Mouse、Ret  白介素2抗原（大、鼠）
胰酶（1：250），干人脐带间充质干微RNA4-二甲氨基肉桂IL-2 (Interleukin-2)Human  IL-2抗原（人）
DPBS，（1X）（IVD）人肺间充质干微RNA4-二甲氨基肉桂IL-23(Interleukin-23)  白介素-23抗原
人上皮微RNA甲基-1-硫代-Β-D-半乳糖苷IL-4(Interleukin-4)  白介素4抗原
人成纤维微RNA10-(2-Benzothiazolyl)-2,3,6,7-Tetrahydro-1,1,7,7-Tetramethyl-1H,5H,11H-(1)Benzopyropyrano(6,7-8-I,j)Quinolizin-11-OneIL-4(Interleukin-4)human peptide  白介素4抗原
DPBS，（1X），（IVD）人脐静脉内皮微RNA1-(3-三基)IL-5 peptide  白介素5抗原
人脐动脉内皮微RNA1-乙基-3-甲基咪唑六磷盐[用于熔盐]IL-6 (Interleukin-6) Human  白介素6
DPBS，（10X），（IVD）人脐静脉平滑肌微RNA1-乙基-3-甲基咪唑六磷盐[用于熔盐]IL-7(Interleukin-7)  白介素7抗原
PBS，（1X）人脐动脉平滑肌微RNA3-基吡唑-4-羧乙酯IL-6R Alpha (IL6R-alpha)  白介素6受体α抗原
橄榄苦苷3-基吡唑-4-羧乙酯gp130/IL-6R  白介素-6受体抗原
PBS，（10X）党参炔苷3-基吡唑-4-羧乙酯IL-7Ra/CD127 peptide  白介素-7受体a抗原
PBS，（1X）鼠尾草N,N,N',N'-四苯基联苯胺ING1/p33(inhibitor of growth gene 1)  生长抑制因子基因1抗原
迷迭香N,N,N',N'-四苯基联苯胺Inhibin Alpha  抑制素α抗原
PBS，（10X）黄豆黄苷N,N,N',N'-四苯基联苯胺Inhibin beta A peptide  抑制素beta A抗原
RPMI 1640，（1X），液体（IVD）黄豆黄素(R)-1,1′-联萘-2,2′-二基磷酰Inhibin beta B  抑制素βB抗原
RPMI 1640，（1X），液体（IVD）大豆苷(R)-1,1′-联萘-2,2′-二基磷酰Integrin Alpha3  整合素α3抗原
RPMI 1640，干
（IVD）大豆苷元双(六乙酰)合铜(II)Integrin Beta5  整合素β5抗原
染料木素双(六乙酰)合铜(II)Integrin alpha 1  整合素α1抗原
RPMI 1640，干
（IVD）染料木苷3-甲氧基苯硫酚Integrin Alpha4 Beta7/LPAM-1 (Lymphocyte Peyer’s patch Adhesion Molecule 1/Integrin alpha4,beta7)  整合素α4β7抗原
RPMI 1640，（1X），液体 （ IVD）欧前胡素3-甲氧基苯硫酚Integrin AlphaE2/CD103  整合素αE2抗原
DMEM（低糖），液体异欧前胡素3-甲氧基苯硫酚ENPP3/CD203c(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3)  ENPP3抗原
DMEM（低糖），干远志L-(-)-半乳糖IQGAP1  支架蛋白抗原
DMEM（高糖），液体远志皂苷元L-(-)-半乳糖IRF-1(Interferon regulatory factor-1)  干扰素调节因子抗原
莱苞迪甙A钆(III)IRAK 2  白介素-1受体相关激酶2
DMEM（高糖），液体黄芩苷4,6-二甲基嘧IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist)peptide  白介素-1受体拮抗剂抗原
DMEM（高糖），液体野黄芩苷（灯盏花乙素）(甲基)甲基二硅烷Integrin a7(integrin alpha 7)  整合素α7抗原
DMEM（高糖），干黄芩素(甲基)甲基二硅烷integrin Beta1(ITG- Beta1/CD29)  粘附分子整合素β1抗原
大鼠视网膜色素上皮细胞秦皮素2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic AcidIntegrin Alpha5(ITG- AlphaV/CD49e)  粘附分子整合素α5抗原
DMEM（高糖），干秦皮甲素2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic AcidIntegrin alpha V/CD51 peptide  整合素αV抗原
秦皮乙素2-溴-1,3-二-5-苯JAK1(Tyrosine-protein kinase JAK1; Janus kinase 1)  蛋白质酪氨激酶JAK-1抗原