实验开始前，各试剂和样本均应平衡至室温；样本复融后需再次离心，取上清检测；试剂或样本配制时，需充分混匀并尽量避免起泡；标曲和样本建议做复孔检测。
1. 加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。
2. 生物素化抗体/抗原：弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液100 μL，混匀，酶标板加上覆膜， 37℃孵育1小时。
3. 洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。
4. HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100 μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。
5. 洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤3。
6. 底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显se 情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。
7. 终止：每孔加终止液50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
8. 读值：立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。
9. 实验完毕后，将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。