人B-**细胞趋化因子1(BLC-1/CXCL13)酶联**分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中BLC-1/CXCL13含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标**分析法测定标本中BLC-1/CXCL13水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入BLC-1/CXCL13抗原、生物素化的抗人BLC-1/CXCL13抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的BLC-1/CXCL13呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96孔) 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10000 pg/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成10000 pg/mL,5000 pg/mL ,2500 pg/mL,1250 pg/mL,625 pg/mL,310 pg/mL,156 pg/mL,其原液直接作为*高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL,临用前15分钟内配制。 如配制5000 pg/mL标准品:取0.5ml 10000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。 2. 样品稀释液:1×20ml/瓶。 3. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。 4. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。 5. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 6. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 7. 底物溶液:1×10ml/瓶。 8. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 9. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 标本的采集及保存 1.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。 2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。 注:标本溶血会影响*后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37℃反应120分钟。 2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。 3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul,37℃,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul,37℃,60分钟,洗板5次,甩干。 5. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。 6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 注: 1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是*后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。 自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的人BLC-1/CXCL13,且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 注意事项 1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。 2. 一次加样时间*好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 3. 请每次测定的同时做标准曲线,*好做复孔。 4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请*后乘以稀释倍数。 5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。 6.底物请避光保存。 说明 1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,**个孔与*后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且,洗涤不充分将影响试验结果。 3. 试剂盒保存:部分试剂保存于-20℃,部分试剂保存于2-8℃,具体以标签上的标示为准。 4. 浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。 6. 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。 7. 所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。 8. 有效期:6个月