MTT比色法检测TNF的生物活性

【操作步骤】
（1）取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液；
（2）用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；
（3）将上述细胞悬液加至96孔培养板，100 ul/孔；
（4）置37℃，5% CO2培养箱中培养24h；
（5）吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照（即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液）；
（6）同时向各孔均加入10ul放线菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7）置37℃，5% CO2培养箱中培养12-14h；
（1） 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔 ，37℃孵育4h；
（2） 从每孔中轻轻吸出培养上清液100μl/孔 ，弃去 ，再于每孔中加入酸化异丙醇或DMSO，100μl/孔，混匀，置室温10min；
（3） 用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm分别测各孔OD值。
【结果分析】
（1） 取双复孔平均值，各孔OD值为OD570nm-OD630nm，再减去空白对照OD值。
（2） 根据各孔OD值，分别计算出各稀释度的标准品和待测样品对应的L929细胞死亡率。可按下式计算：
各孔细胞死亡率 = 阴性对照孔OD-含TNF孔OD × 100% 
阴性对照孔OD

（3）以Log2[稀释度]为横座标（X），以细胞死亡率（%）为纵座标（Y），分别绘制标准曲线和待测样品曲线，根据导致50%细胞死亡的标准品和待测样品曲线，根据导致50%细胞死亡的标准品和待测样品稀释度，按下式计算样本TNF的活性单位：
TNF的活性单位
（U/ml） = 标准品导致50%细胞死亡的待测样品稀释度 × 标准品活性单位
（U/ml） 
导致50%细胞死亡的标准品稀释度

（4）亦可根据正态概率纸法和概率单位法求得待测样品TNF活性单位，可参见IL-1、IL-2的生物活性检测部分及医学统计学的有关内容。
【注意事项】
（1） L929细胞要充分洗涤，以去除原培养液，同时应均匀分布于各孔中，以免影响检测结果。
（2） L929细胞不宜生长过密，只要孔内长成单层即可使用。
（3） L929细胞存活率应＞95%。
（4） L929细胞随着传代或受其他因素影响，对放线菌素D的敏感性会有差异，应先作预试验确定其使用浓度。
（5） 倍比稀释TNF标准品和待测样品时，应以1:2开始至少6个稀释度。
（6） MTT染色，其着色深浅不但与细胞数有关，还与细胞激活有关。如某种因素激活细胞后，其代谢率将增强，线粒体琥珀酸脱氢酶活性亦增强，着色也将加深。因此MTT染色时，应考虑待测样品中是否含有能激活靶细胞的因素存在。
（7） 加入酸化异丙醇后，应在1h内测定各孔OD值。
（8） 本法亦可适用于待测细胞mTNF的检测。