您好,欢迎来到仪表展览网!
请登录
免费注册
分享
微信
新浪微博
人人网
QQ空间
开心网
豆瓣
会员服务
进取版
标准版
尊贵版
|
设为首页
|
收藏
|
导航
|
帮助
|
移动端
|
官方微信扫一扫
微信扫一扫
收获行业前沿信息
产品
资讯
请输入产品名称
噪声分析仪
纺织检测仪器
Toc分析仪
PT-303红外测温仪
转矩测试仪
继电保护试验仪
定氮仪
首页
产品
专题
品牌
资料
展会
成功案例
网上展会
词多 效果好 就选易搜宝!
广州晶欣生物科技有限公司
新增产品
|
公司简介
注册时间:
2009-12-09
联系人:
电话:
Email:
首页
公司简介
产品目录
公司新闻
技术文章
资料下载
成功案例
人才招聘
荣誉证书
联系我们
产品目录
实验仪器
电泳设备
离心机
混合器混合仪
蓝光切胶仪
电动吸液器
实验耗材
分离纯化
病理耗材
PCR\QPCR耗材
防护用品
匀浆类耗材
各式移液器吸嘴
离心管
磁力架
封板膜封口膜封瓶膜
深孔板
生化试剂
荧光探针和荧光染料
氘代物
脂蛋白
发色底物
氨基酸
PEG修饰
细胞学实验
细胞培养耗材
细胞培养检测
培养添加剂
细胞培养试剂
细胞转染剂
细胞株\系
类器官
免疫学实验
药物单抗
IG类亚类抗原
内参抗体及标签抗体
二抗及标记
其他产品
蛋白学实验
蛋白质纯化介质
蛋白提取
多肽
蛋白细胞因子
封闭液
抗体稀释剂
蛋白分子量标准 Protein Markers
WB发光液
蛋白转膜
蛋白电泳
即用型试剂
即用型干粉
即用型溶液
染色液
动物学研究
动物造模剂
动物实验
动物饲料
微生物学实验
微生物培养基
小分子化合物
分子生物学研究
核酸实验
感受态
酵母研究相关产品
缺陷型氨基酸
SC+缺陷氨基酸
SD+缺陷氨基酸
SD+缺陷氨基酸琼脂
标准品
植物中药标准品提取物
热销及特色产品
MBCHEM
胶原酶
其它
当前位置:
首页
>>>
技术文章
>
技术文章
细胞培养用液的配制与**
一、器材与试剂:
干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤:
(1)水的制备:
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
(2)PBS的制备与**(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):
1.溶解定容:将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待**:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅**20分钟。注意高压**后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
(3)胰蛋白酶溶液的配制与**:
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤**:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
(4)青、链霉素溶液的配制于**
1.所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克
(5)RPMI1640的制备与**:
1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。
2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待**。
3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。
(6)血清的灭活:
细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。
(7)HEPES溶液:
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid)。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下:
准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。
注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。
(8)谷氨酰胺:
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
(9)肝素溶液的配制:
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为℃。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。
(10)Ⅰ型胶原酶:
0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和**灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
(11)明胶溶液:
因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1%的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。
(12)其他培养用液的配制:
20ug/ml内皮生长因子,
注意事项:
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。
五.细胞传代培养(消化法)
具体操作:
(1)传代前准备:
1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒��灯:注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的**后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次**。
6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口**。
(2)胰蛋白酶消化;
1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。
2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。
(3)吹打分散细胞:
1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6~8分钟。
4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
(4)分装稀释细胞:
1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
(5)继续培养:
用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。
传代细胞培养注意事项:
1.严格的无菌操作
2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:
EDTA0.20g,NaCl8.00g,KCl0.20g,KH2PO40.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。
六.细胞的复苏
细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
具体操作
(1)实验前准备:
1.将水浴锅预热至37℃
2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
(2)取出冻存管:
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
(3)迅速解冻:
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。
(4)平衡离心:
用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min离心3min
(5)制备细胞悬液:
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。
(6)细胞计数:
细胞浓度以5×105/ml为宜。
(7)培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误:
1水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。
上一篇:
RNA的斑点及狭缝印迹杂交
下一篇:
MTT比色法检测TNF的生物活性
若网站内容侵犯到您的权益,请通过网站上的联系方式及时联系我们修改或删除
粤公网安备 44011202000535号