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分光光度计的应用常识

　 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，因此产生特定波长的光源，光源透过调试的样本后，部分光源被吸收，计算样本的吸光值，因此转化成样本的浓度。样本的吸光值与样本的浓度成正比。
　　核酸的定量
　　核酸的定量是分光使用频率*高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的*高吸收峰的吸收波长 260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。调试后的吸光值经过上述系数的换算，因此得出相应的样本浓度。调试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后调试空白液和样本液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者***的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和**度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次调试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在调试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样本的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样本中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样本。这些小颗粒的存在干扰调试效果。为了*大程度减少颗粒对调试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值*好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。

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