凯氏定氮法测定黄豆的粗蛋白含量
一、原理
利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 → (NH4)2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
2NH3 +4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4H3BO3
二、仪器与试剂
1、100mL凯氏烧瓶
2、微量凯氏定氮装置
3、试剂
硫酸铜 硫酸钾 硫酸 2%硼酸溶液
混合指示剂:0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%甲基蓝乙醇溶液,临用时按2:1的比例混合.或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5的比例混合。
20%NaOH溶液 0.01mol/L HCl标准溶液
三、测定方法
1、样品消化：
准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.3g左右，小心移入干燥的凯氏烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5g CuSO4、3g K2SO4及10mL浓硫酸，于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽出消化过程所产生的烟气。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化，泡沫消失后再加大火力，消化至溶液透明呈蓝绿色。取下抽气管，继续加热 0.5h,冷却至室温。
取20mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，待样品冷至室温，移入100mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，并入容量瓶，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。
同时做一空白消化。
2、蒸馏与吸收：
1>按蒸馏装置图安装好装置，将所有的夹子打开。取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好。并给冷凝管接通冷凝水。
2>往蒸汽发生瓶加入蒸馏水至其体积的三分之二处，加入几粒沸石和4滴甲基橙，再加入3mL浓硫酸，然后置于电炉上加热使水沸腾。
3>产生蒸汽后，夹上夹子1，让蒸汽经导管进入反应管外套，待废液排放口排出蒸汽后，夹上夹子3，使蒸汽进入反应管，蒸馏洗涤10分钟。打开夹子1，同时夹上夹子2，待反应管内的水全部排出到外套后，打开夹子3，排出废水。马上从进样口加入蒸馏水约20mL，立即再夹上夹子3，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。
4>将全部夹子打开，吸取10mL样液（或空白液）从样品加入口加入到反应管内，插上磨口塞。量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，然后将此吸收液置于冷凝管下端，冷凝管下端应插入到液面以下。再从样品加入口加入约20mL20%NaOH溶液使反应管内的样液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，用少量水洗涤加入口，插好磨口塞，并用少量水封口。
5>夹上夹子1，让蒸汽经导管进入反应管外套，待废液排放口排出蒸汽后，夹上夹子3，使蒸汽进入反应管，蒸馏开始，待吸收液变蓝后计时蒸馏10分钟,将冷凝管下端提离吸收液面，再蒸馏1分钟，用萘氏试剂检查无氨后，停止承接蒸馏液。打开夹子1，同时夹上夹子2，待反应管内的样品废液全部排出到外套后，打开夹子3，排出废液。马上从进样口加入蒸馏水约20mL，立即再夹上夹子3，待水排出，反复操作洗涤3次，再作样品平行测定。测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。
3．滴定：
用0.01mol/LHCl滴定吸收液至变为红色为终点，记下消耗的HCl体积。
四、计算：
蛋白质% =
C —HCl标准溶液的浓度mol/L
V1 —滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积mL
V2 —滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积mL
m — 黄豆粉的质量g
F —黄豆的蛋白质含量换算系数5.71
