关于使用超微量分光光度计Nano-100的一些注意事项
关于软件操作的问题
1、 若电脑上已安装有该操作软件,则在仪器使用前必须先点击“Diagnostics”,使软件与仪器相互识别;
2、 安装软件后,若不能进入操作界面,则是电脑操作系统的问题,换一台电脑即可(盗版的电脑系统往往出现该问题);
3、 按“Blank”调零之后,若Abs=0,则浓度会自动显示上一次测得的浓度。
4、 按“Blank”调零之后,经过几次样品的测量,再测调零的水的浓度,读数和曲线不会一致。这是所有的超微量分光光度计都存在的系统误差,调零读数范围在0-1ng/ul内均属正常。个别牌子的产品甚至不显示调零读数。
5、 仪器的调零在浓度测定过程中非常重要。为验证调零的重要性,我们作如下比较:**次调零,清洗样品台一次,调零一次,然后上2ul样品测定(C=1020ng/ul)浓度,重复3次;**次调零,清洗样品台三次,调零一次,然后上2ul同样的样品测定浓度,重复3次,比较结果如表1所示。结果显示,调零时,反复清洗样品台多次,读数更准确。
表1. 两种方法调零的结果比较(平均值)
Num
Type
260nm
280nm
230nm
260/280
260/230
C:ng/uL
调零1
DNA-50
17.833
7.648
6.701
2.33
2.66
891.664
调零2
21.334
10.961
10.054
1.95
2.12
1066.704
样品状态对测试结果的影响
1、 测试结果中,若DNA样品的260/280比值不属于1.8-2.0范围,则可以判定样品的纯度太低。像这样纯度低的样品,追求浓度的**已经没有意义。因为样品已经较多的杂质,干扰吸光度的测定,因而读数会偏离真实值。而且过多杂质的存在,导致实验人员无法**获取所需的DNA摩尔数,实验也就谈不上准确可靠。同理,RNA和蛋白质样品也一样。
2、 经测试,核酸样品在半融化和全融化状态下,测得的浓度有较大差别。如表2所示(DNA样品浓度为920ng/ul),全融化状态下的样品相比半融化时浓度更高,更准确。这是因为DNA分子在不同的温度下超螺旋程度不一样,而OD260是由含氮碱基产生的。低温状态下,DNA分子冻结,超螺旋程度较高,碱基包裹在内,吸收的紫外光较少,反映到仪器上就是浓度读数偏低。反之,随着温度的上升,超螺旋逐渐散开,碱基暴露,吸光度增大,因而读数升高。由此可推断,相同质量的寡聚核苷酸、RNA和DNA吸光度大小关系是:寡聚核苷酸˃RNA˃DNA。
因此,用Nano-100等超微量分光光度计对核酸浓度进行**测定时,应确保样品全部融化并且混匀,或在冻存之前测定浓度,这样得到的结果才更准确可靠。
表2. 样品在半融化和全融化状态下浓度的测定结果(平均值)
半融化状态
16.995
7.937
7.03
2.14
2.42
849.759
全融化状态
18.23
8.203
7.165
2.22
2.54
911.527