双光子共聚焦显微镜

                            双光子共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：
一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。
光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞**，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。
 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
使用单激发光源，双光子具有相同的波长，该技术被称为双光子激发荧光显微术。如果两个光子具有不同的波长，就称作双色激发荧光显微术。
双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度（两个光子必须在10－18秒内到达）。双光子吸收截面很小，对若丹明B一般为10－50cm4 s photon－1 molecule－1，这样，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。钛宝石激光器等锁模的，高峰值功率激光可以为双光子激发提供足够的强度。
由于激发强度随到焦平面的距离的平方变化，在z轴方向双光子激发几率随离焦距离的四次方衰减，荧光团激发只发生在焦点内。用数值孔径为1.25的物镜，激发波长为780纳米，全部激发荧光的80%被局限在焦平面1微米范围内，激发体积大约为0.1-1飞升，与传统荧光显微镜相比，该体积降低了1010倍。
在激光扫描荧光显微术中，双光子激发具有三维层析能力，该三维层析效果可与共焦显微镜相比拟，它还比具有另外两个优势：因为照明光在时间空间上汇聚，没有离焦光漂白；激发光不会被离焦吸收衰减，因而有较大的穿透深度。
双色激发比双光子激发的优势并不在于较高的分辨率，而是在于小目标物经过较大散射媒质后更容易观察。事实上，与双光子激发比较，双色激发在焦点内荧光散射增加，而干扰背景荧光只有很小增加。
    结合多光子荧光技术，多光子共聚焦显微镜（Multiphoton Excitation－MPE）的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜（单光子共聚焦显微镜）所存在的问题，MPE的激光源是超快激光器（多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度），具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比。在传统激光共聚焦显微镜中，光通过出的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。在MPE中，焦点处发出的所有荧光，包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到。并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长，激发光的散射损失很小，轴向分辨率更高，样品的穿透能力更强。