免丨疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与ProteinA/G偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
在免丨疫沉淀实验后的WB验证环节中，当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时，通常会出现对应免丨疫沉淀一抗变性后产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。
如何避免IP检测过程中的重、轻链干扰？
一般解决办法：选择不同种属来源的一抗分别进行IP和WB实验，然后再选择无种属交叉反应的二抗进行WB实验；这种方案相对来说比较昂贵，需要买两个一抗和两个对应的二抗。
Abbkine解决方案：产生此问题的重点在于实验中目的蛋白的信号模糊，无法进行判断，那就需要在根本上将干扰的信号降到*低，而IPKine系列二抗经过特别设计和优化，可以和重/轻链特异性结合从而明显看到目的蛋白信号。如果目的条带在55kDa左右，可以通过选择与轻链特异性结合的二抗，来消除重链条带对目的蛋白检测的干扰。如下图：
IPKine是一系列新型的二抗产品，能有效解决IP-WB后的轻/重链干扰问题。IPKine系列二抗经过特别优化，不会与IgG的轻/重链分子结合，只识别IgG分子的重/轻链部分，从而能有效解决IP实验后的WB检测中面临的轻/重链干扰信号降到*低。
另外，IPKine系列二抗经过特别优化，其针对目的种属的特异性非常高，同时针对其他非目的种属的抗体分子的非特异性结合降到*低，从而有效避免了二抗与样本内免丨疫球蛋白分子的非特异性杂交，提高实验的特异性和信噪比。
IP实验常见问题汇总：
结果
原因
解析
显影信号整体很弱，荧光信号淬灭
显影液失效
通过检查显影液清澈度初判，并通过立即更换新显影液后再曝
底物失效
将PVDF膜重新TBST略洗几次，重新加合格的底物
二抗孵育过多
如果操作较快，会出现第1张胶片曝光后信号极强，而第2张起可能信号淬灭；如果操作稍慢点，甚至第1张胶片起信号基本淬灭，这种情况建议重做，降低二抗浓度、减少孵育时间
条带正确，但显影过强或过弱
上样量过大
可减小上样量、提高一抗稀释度并缩短曝光时间
上样量过小
可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间
背景杂乱厚重，大片“黑区”，导致无法分析
一抗孵育时间过长 或浓度过高
4℃封闭过夜，一抗孵育1 hr，并可适当增加洗膜时间
Input泳道无目的带，而IP泳道有
目的蛋白丰度不高，无法直接 Western blot 检出，而 IP 能进行浓缩富集
Input泳道有目的带，而IP泳道无
该种一抗主要识别和结合靶蛋白内部的线性表位、而非暴露在外表的的线性或空间表位，故IP制样时无法有效捕获住组织或细胞中的完整结构靶蛋白
该蛋白浓度极低，导致捕获过程不仅未起到富集作用，反而因为洗涤操作，使靶蛋白损失殆尽，*后几乎无靶蛋白被洗脱下来；或lysis buffer过强；或选用了不正确的beads； 或一抗亚型为 IgM 或 IgA
Abbkine专注于蛋白学和细胞学领域，致力于创丨新和研发各类抗体、蛋白质、分析试剂与试剂盒，以期成为生命科学研究发展、药丨物研发等领域的关键推动者。我们为您提供蛋白和免丨疫研究用户*喜爱的产品，从免丨疫学基础产品，如蛋白提取定量，到免丨疫学实验的内参标签抗体、一抗及二抗等；细胞研究用户*喜爱的产品，从用于检测细胞状态的染料及试剂盒，细胞器提取试剂盒，细胞亚结构染色示踪及细胞代谢检测产品，到用于细胞培养的细胞因子及蛋白类检测试剂盒，只为助力您的研究事业！