睡眠剥夺对大鼠脾脏**细胞生物钟基因表达水平的影响
邢陈1 ，顾晔1，2 ，徐秀段1 ，邹书仙1 ，胡永亮1 ，胡美茹1 ，宋伦1
［摘要］ 目的 探讨 72 h 睡眠剥夺( sleep deprivation，SD) 对大鼠脾脏**细胞生物钟基因表达水平的影响。方法 将大鼠随机分为正常对照组和SD 组。SD 组大鼠使用SD 仪进行睡眠剥夺72 h 后，取脾脏制备成单细胞悬液， 利用**细胞分离液获得**细胞; 分别通过 ＲT-PCＲ 和**印迹方法检测大鼠脾**细胞中生物钟基因mＲNA和蛋白水平的变化。结果 与正常对照组相比，SD 组大鼠脾脏生物钟基因 bmal1、clock、per2、rev-erbα 的mＲNA相对表达水平呈现显著下调，而 npas2、per1、rorα、cry1 mＲNA 相对表达水平无显著变化。与正常对照组相比，72 h SD 后脾脏**细胞 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表达水平显著下调，PEＲ1 蛋白表达水平呈升高趋势，而 ＲEV- EＲBα 蛋白表达水平无显著变化。结论 72 h SD 应激条件可在转录和翻译水平诱导大鼠脾多种核心生物钟基因 表达水平发生异常改变。
［关键词］ 睡眠剥夺; 昼夜节律; 生物钟; 基因表达; **细胞
昼夜节律产生和维持的遗传基础受控于由一系 列生物钟基因( bmal1、clcok、cry、per、rev-erbα、rorα、dbp、tef、hlf 等) 构成的负反馈环路［1 ～ 3］。生物钟基因广泛存在于机体各**器官、组织和细胞中，使得**细胞迁移和趋化，吞噬、杀伤活性等**功能以及循环**细胞及其亚群的相对和**数量、细胞因子水平等多种**参数呈现显著的昼夜节律性变化，从而在维持**稳态中发挥重要作用［4，5］。
睡眠 － 觉醒周期是机体重要的一种昼夜节律现象，对维持个体生存和正常生理、心理功能至关重要。与睡眠 － 觉醒周期节律性转换相适应，细胞因子分泌水平、循环**细胞数目、**细胞功能及活性等多个方面都呈现昼夜节律性变化［6 ～ 9］。由睡眠剥夺( sleep deprivation，SD) 、睡眠缺失和睡眠相关**等引起的睡眠节律紊乱后，机体**功能呈现 显著异常变化［10 ～ 13］。由于昼夜节律的遗传基础是由生物钟基因决定的，睡眠节律紊乱诱发的**功 能异常应与昼夜节律和生物钟系统具有密切关系。脾脏是机体重要的外周**器官，本研究拟定通过SD 诱发的睡眠节律紊乱动物模型为研究起点，直接研究 SD 对脾脏生物钟基因表达的影响，期望阐明睡眠节律紊乱对脾脏内源性昼夜节律和生物钟系统 的影响。
1 材料与方法
1． 1 材料
TＲIzol 试剂( Sigma 公司) ; 逆转录试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒( Thermo 公司) ; 琼脂糖粉( Lonza 公司) ; PBS 缓冲液( Gibco 公司) ; ＲIPA 组织裂解液( 碧云天生物公司) ; 抗 BMAL1、CLOCK、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、PEＲ2、ＲOＲα、ＲEV-EＲBα 和 β-ACTIN抗体( Santa Cruz 公司) ; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗( 鼎国昌盛生物公司) ; ECL 显色液( 天根生物公司) 。
1． 2 睡眠剥夺动物模型构建
将 12 只 SD 大鼠( 雄性，体质量 180 ～ 200 g) 按随机数字表法分为正常对照组和 SD 组，每组 6 只。在**科学院**医学研究院实验动物中心饲养， 给予12 h 光照/12 h 黑暗交替处理，适应环境7 d 后开始实验。SD 组大鼠采用 DB036 型 SD 仪( 北京智鼠多宝生物科技有限公司) 进行 SD 处理 72 h。在此过程中，每只大鼠都处于独立的空间，可自由进食 和饮水。
1． 3 标本采集
在进行 72 h SD 后，用 2% wu***钠将大鼠麻醉，取脾脏制备成单细胞悬液，利用**细胞分离液分离获得脾**细胞，分别加入 TＲIzol 和ＲIPA裂解液制备成 ＲT-PCＲ 和 Western 印迹实验样品。
1． 4 ＲT-PCＲ
用TＲIzol 抽提脾**细胞总ＲNA 并测定浓度， 按照逆转录 PCＲ 试剂盒说明逆转录合成 cDNA， PCＲ 扩增 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev- erbα、rorα 基因。表 1 列出相应生物钟基因引物序列信息。
1． 5 Western 印迹检测
ＲIPA裂解脾**细胞后，4 ℃ 12 000 r / min离心 30 min，取上清用 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。各样品取等量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，并进行转印。用 5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h，经过一抗 4 ℃ 孵育过夜、二抗室温孵育1 ～ 2 h后，用ECL蛋白显色液试剂显色，在暗室红外光下显 影，检 测BMAL1、CLOCK、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、PEＲ2 、ＲEV-EＲBα、ＲOＲα 蛋白表达水平变化情况。
1. 6 统计学分析
利用 SPSS19． 0 软件进行数据分析，所有数据用 x珋± s 表示，组间差异比较采用 t 检验。P ＜ 0． 05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 睡眠剥夺对大鼠脾**细胞中生物钟基因mＲNA 表达水平的影响
为了在转录水平分析睡眠剥夺对脾**细胞核心生物钟基因表达的影响，通过 ＲT-PCＲ 检测正常对照组和睡眠剥夺组大鼠脾**细胞核心生物钟基 因 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα 和 rorα mＲNA 表达水平。结果显示，与正常对照组相比，72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 bmal1、clock 和 rev-rebα mＲNA 表达水平呈现一定程度降低变化，而 npas2、cry1、per1、per2 和 rorα mＲNA 表达水平无显著改变( 图 1) 。以上结果表明，睡眠剥夺应激条件下脾各生物钟基因的转录活性所受影响存在差异，bmal1、 clock 和 rev-erbα 对睡眠剥夺应激因素相对于其他核心生物钟基因更为敏感。
2．2 睡眠剥夺后大鼠脾**细胞生物钟基因mＲNA相对表达量的变化
通过灰度扫描对睡眠剥夺后大鼠脾**细胞核 心生物钟基因 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα、rorα mＲNA 表达水平进行相对定量分析，以进一步明确睡眠剥夺对脾**细胞生物钟基因mＲNA 表达水平的影响。结果显示，与正常对照组相比，72 h 睡眠剥夺后脾**细胞 bmal1、clock、 per2、rev-erbα 的 mＲNA 相对表达水平呈显著下调， 而 npas2、per1、rorα、cry1 mＲNA 相对表达水平无显著变化( 表 2) 。以上结果进一步表明，睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟基因 mＲNA 表达水平受到较为显著影响，但各生物钟基因对睡眠剥夺应 激因素的敏感性存在差异。
2．3 睡眠剥夺对大鼠脾**细胞中生物钟蛋白表达水平的影响
为了在翻译水平分析睡眠剥夺对脾核心生物钟 基因表达的影响，通过**印迹方法检测正常组和 睡眠剥夺组中大鼠脾**细胞核心生物钟基因bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα 和 rorα 的蛋白表达水平。结果显示，与正常对照组相比，72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表达水平显著下调，PEＲ1 蛋白表达水平呈升高趋势，而 ＲEV-EＲBα 蛋白表达水平无显著变化( 图 2) 。此外，CLOCK 和 PEＲ2 蛋白可能因表达丰度较低在正常对照组和睡眠剥夺组未检测到较为 显著的蛋白信号。以上结果表明，睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟基因蛋白表达水平受到显著影响。
2．4 睡眠剥夺后大鼠脾**细胞生物钟蛋白相对表达量的变化
通过灰度扫描进一步对睡眠剥夺后大鼠脾** 细胞核心生物钟蛋白 BMAL1、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、ＲEV-EＲBα 和 ＲOＲα 的表达水平进行相对定量分析。结果显示，与正常对照组相比，72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1、NAPS2、CＲY1 和 ＲOＲα 蛋白表达水平显著下调，PEＲ1 蛋白表达水平显著升高，而 ＲEV-EＲBα 的蛋白表达水平无显著改变( 表3) 。以上结果进一步表明，睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟蛋白表达水平呈较为显著的波动变化。
3 讨论
睡眠 － 觉醒周期与**系统之间存在交互作用，大量研究主要集中在睡眠对**功能的下行调 控作用及机制研究，及以**应答为起点对睡眠的 上行调控作用及机制研究。在睡眠对**功能的调 控作用研究中，睡眠剥夺对**系统昼夜节律和生 物钟系统的影响也逐渐受到关注。前期研究发现， 睡眠剥夺应激条件( 24、36、48 h) 对脾**细胞生物钟振荡幅度的影响相对较小。这可能是由于生物钟 基因的内在相互调控作用使得机体内源性生物钟系 统维持稳定。但当继续将睡眠剥夺时间继续延长至 72 h 后，睡眠剥夺对生物钟基因振荡幅度增加或减弱的影响逐渐显现。本研究中，72 h 睡眠剥夺应激条件诱发的脾多种核心生物钟基因在转录和翻译水平都可受到显著影响，但在总体变化趋势上存在一定差异。在转录水平，72 h 睡眠剥夺后脾**细胞 bmal1、clock、per2、rev-erbα 的mＲNA 相对表达水平呈显著下调，而在翻译水平 72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表达水平显著下调。以上结果表明，睡眠剥夺应激条件对生物钟基因表达调控的影响即可能同时体现在转录和翻译水平( BMAL1) ，也可能仅单独体现在转录水平或翻译 水 平 ( CLOCK、NPAS2、PEＲ2、CＲY1、ＲEV-EＲBα、ＲOＲα) 。造成以上结果的原因，一方面可能是由于生物钟的表达呈现节律性振荡规律，而在转录和翻译过程存在时间错位，使得生物钟基因的mＲNA 和蛋白变化趋势可能在同一时间节点存在错位和差异。另一方面，除在转录水平，生物钟基因在翻译、翻译后修饰和降解机制方面也存在周期性振荡变化［14 ～ 16］。因此，睡眠剥夺诱发的脾**细胞clock、npas2、per2、cry1、rev-erbα、rorα 在 mＲNA 和蛋白表达水平的差异变化，可能也是由于睡眠剥夺应激因素对以上生物钟蛋白的翻译、翻译后修饰和降解机制方面产生的影响所引起的。
本研究结果表明，脾多种核心生物钟基因表达 水平在睡眠剥夺应激条件下呈现显著的异常变化。在本研究体系中，bmal1、clock、npas2、per1、per2、cry1、rev-erbα 和 rorα 都分别在 mＲNA 或者蛋白水平受到不同程度的影响。以上结果表明，脾作为机体 重要的外周**器官，其内源性的生物钟系统在睡 眠剥夺应激条件下发生一定程度的异常波动。因 此，脾**细胞生物钟系统表达调控异常变化也可 视作睡眠剥夺诱发**系统功能异常的重要早期病 理效应之一。