头穴透刺对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经生长因子表达的影响
牛彦彦 鲍春龄 岳亚琳 石程
摘要 目的 观察头穴透刺法对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经生长因子( NGF) 表达的影响。方法健康雄性 Wistar 大鼠120 只，按照随机数字表法分为假手术组、模型组、针刺组，每组 40 只，每组再随机分为6 h、24 h、3 d、7 d 4 个时点。采用改良的自体动脉血法制备大鼠脑出血模型，给予“百会”透“太阳”穴电针干预。通过 Longa 评分法进行神经行为学评估，**组织化学法检测血肿周围脑组织 NGF 的阳性细胞表达，q- PCＲ 法检测 NGF mＲNA 表达量。结果与假手术组比较，模型组各时点神经行为学评分升高，NGF 阳性细胞数增多，NGF mＲNA 表达上调，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05) ; 与模型组比较，针刺组 6 h 神经行为学评分、 NGF 的阳性细胞数，NGF mＲNA 表达均无明显变化，差异无统计学意义(P ＞ 0. 05) ，针刺组24 h、3 d、7 d 神经行为学评分降低，NGF 阳性细胞数增多，NGF mＲNA 表达上调，差异有统计学意义 (P ＜ 0. 05) 。结论 “百会”透“太阳”头穴透刺通过上调 NGF 基因及蛋白的表达，促进脑出血大鼠神经功能恢复，具有良好的神经保护作用。
关键词 头穴透刺; 脑出血; 神经保护; 神经生长因子
脑出血( intracerebral hemorrhage，ICH) 后血肿造成脑实质损害，血肿边缘的半暗带区发生一系列的病理生理过程，脑组织血液供应障碍，缺血缺氧，导致水肿半暗带的细胞死亡，从而出现脑功能障碍。积极有效地保护脑出血后神经元的损伤，挽救脑出血半暗带，恢复其神经功能，仍然是目前神经科学研究的重点和难点。神经生长因子( never growth factor，NGF) 具有维持交感神经和感觉神经细胞存在，促进神经细胞分化，决定轴突生长方向，促进损伤的**神经修复，维持生存及诱导突起生长的作用，对**神经损伤起到重要的神经保护作用［1］。近年来人们对 NGF 结构与神经损伤相关部位的功效有了广泛深入地研究和认识。如 NGF 的信号传递路径［2］、NGF 在炎症疼痛及修复过程中的作用［3］、NGF 的基因表达影响因子［4］、NGF 及受体在肿瘤的形成和肿瘤疼痛中的角色 ［5］及结合神经生长因子各种载体的基因表达［6］等方面都开展了研究。随着对 NGF 功能的了解，对该类**及 NGF 拮抗剂**［7］用于**某些慢性**或者疼痛也进行了很多试验和探索，但针灸对ICH 后脑组织NGF 影响的报道尚不多见［8］。而头针透刺**脑出血的有效性，已经在临床实践中得到广泛的证实［9］。本研究通过“百会”透“太阳”头穴透刺法观察其对脑出血大鼠血肿周围脑组织 NGF 表达的影响，现报道如下。
材料与方法
动物及分组 健康雄性 Wistar 大鼠 120 只，清洁级，体重( 300 ± 20) g，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号: SCXK( 沪) 2012 － 0002，实验动物使用许可证号: SYXK( 沪) 2013 － 0109。室温 22 ～ 25 ℃ ，相对湿度45% ～ 65% ，适应性饲养 1 周。按随机数字表法分为3 组，每组 40 只，每组又随机分 6 h、24 h、3 d、7 d 4 个时点，每个时点 10 只动物，5 只用于**组化检测，5只用于 q-PCＲ 检测。
主要试剂及仪器 脑立体定位仪 SＲ-6N 型 ( 日本Stoelting 公司) ，电动颅骨钻 DB014( 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司) ，100 μL 微量进样器( 上海高鸽工贸有限公司) ，德国莱卡 2135 型切片机，美国Moticam3000 显微摄影成像系统，华佗牌针灸针( 苏州医疗用品厂有限公) ，电针**仪: G6805-Ⅱ型( 上海华谊医用仪器有限公司) ，超细匀浆器 F6 /10 － 6G ( Fluko 上海流体机械制造有限公司，q-PCＲ 仪 ViiA7( life technology ABI ) ，Anti-NGF antibody ( ABCam，ab6199) ，K5007 型组化试剂盒、DAB 显色剂( DAKO 公司) 、BioTNT 逆转录试剂盒等。
1 方法
3. 1 ICH 模型制作 参照任泽光的方法［10］复制脑出血模型并进行改良，调整立体定向仪使门齿钩平面比耳间线平面低 2. 4 mm，头颅背侧剪去鼠毛，75%酒精**后于正中切开约 10 mm 纵行切口，30% 的双氧水剥蚀骨膜，暴露前囟点 bregma，于 bregma 点正中，中线右侧旁开 3. 5 mm 向后 0. 2 mm 处，用微型打磨电钻钻一直径约 1 mm 的小孔，注意不伤及硬脑膜，将微量进样器固定于此。用微量进样器进针抽取 100 μL 自体股动脉血液，向脑内注射，深度为 6. 0 mm，匀速注射自体动脉血，10 min 内注射完毕后留针10 min，移出针头，骨蜡封闭针孔，碘伏**，缝合头皮。术后标准 鼠笼分笼饲养，给予 12 h 光照 12 h 黑暗循环，饲养温度 20 ～ 25 ℃ ，相对湿度 40% ～ 65% ，自由进水及食物。
3. 2 分组处理方法 按随机数字表法分为假手术组: 向大鼠脑内尾状核中心部注入 100 μL 0. 9% 的生理盐水。模型组: 向大鼠脑内尾状核中心部注入100 μL 自体股动脉血，不做干预。针刺组: 大鼠造模成功后 1 h，给予“百会”透“太阳”穴电针干预，百会在大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点( 相当于人体百会处) ，太阳在外眼角与耳之间的凹陷中( 相当于人体太阳穴) ，参照大鼠穴位图谱的研制［11］。常规**，以0. 25 mm × 30 mm 毫针两根，分别刺入百会( 向右前太阳穴方向) 和右侧太阳穴。将 G-6805Ⅱ型电针仪正极接百会穴毫针，负极接太阳穴毫针，连续波，频率2 Hz， 电流强度 1 mA，留针 30 min。从造模成功后 1 h开始进行针灸**，1 次/ d，直至相应时点取材。
3. 3 观察项目及检测方法
3. 3. 1 神经行为学评分 大鼠苏醒后参照 Longa 法［12］评分。0 分: 未见神经病学征象，无神经功能缺损症状; 1 分: 大鼠被提尾倒悬时，病灶右侧前肢呈屈曲、抬高状态，不能伸展右侧前爪; 2 分: 有向瘫痪侧旋转的征象，即行走右侧转圈; 3 分: 有向病灶对侧跌倒的征象，即行走困难并向右侧倾倒; 4 分: 不能自发行走，意识水平呈下降状态。达到 1 ～ 3 分为造模成功， 采用差额补充的方法以保证每组的实验动物例数。
3. 3. 2 NGF 阳性细胞数 造模完成后相应的时间点，将大鼠处死、取材。先将 0. 9% 的生理盐水和 4% 的多聚甲醛固定液 4 ℃ 预冷。10% 的水合氯醛( 0. 4 mL /100 g) 腹腔注射麻醉，打开横膈，迅速开胸暴露心脏，立刻将输液针头由左心室插入主动脉，剪开右心耳， 生理盐水快速灌注约 250 mL 后，大鼠肝脏由暗红转为浅黄，右心耳缺口处流出液体己澄清，换成 4% 多聚甲醛继续灌注，先快速灌注 100 mL，剩余 150 mL 缓慢滴注。可观察到大鼠四肢剧烈抽搐，全身多处明显的肌肉颤 动。约30 min 后，大鼠颈部、四肢及尾部僵硬。断头，暴露颅骨，取出大脑。用锋利的刀片，于冠状位取针道前 后 1. 5 ～ 2 mm 之间的脑组织。连同包埋架一起投入4% 多聚甲醛内，于 4 ℃ 固定约 24 h，石蜡包埋，制成厚约 4 μm 的切片，进行**组化染色。
Moticam3000 显微摄影系统于 400 倍下摄片，采用Image-pro plus6. 0 病理图像分析系统对阳性表达细胞数进行分析，DAB 显色阳性细胞呈棕黄色或褐色，每张切片随机观察并计数脑出血区血肿周边 5 个不重复视野，计算阳性细胞总数。
3. 3. 3 NGF mＲNA 表达量 组织样品按 50 ～ 100 mg / mLTrizol 加入 Trizol，用电动匀浆器充分匀浆约 1 ～ 2 min; 组织匀浆或细胞破碎后，室温放置5 min，使其充分裂解; 12 000 r / min 离心 5 min，弃沉淀; 按 200 μL 氯仿/ mLTrizol 加入氯仿，振荡混匀后室温放置 15 min; 4 ℃ 12 000 g 离心 15 min; 吸取上层水相，至另一离心管中; 按 0. 5 mL 异丙醇/ mL Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置 5 ～ 10 min; 4℃ 12 000 g 离心 10 min，弃上清，ＲNA 沉于管底;按 1 mL 75 % 乙醇/ mL Trizol 加入 75 % 乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀; 4 ℃ 8 000 g 离心 5 min，尽量弃上清; 室温晾干或真空干燥 5 ～ 10 min; 用 50 μL H2 O，溶解 ＲNA 样品，55 ～ 60 ℃ 5 ～ 10 min。取去除核酸酶的无菌 EP 管，放置冰上; 分别加入 Oligo ( dT) 1 μL，模板 ＲNA 2 μL，去核酸酶的水 9 μL; 70 ℃ 加热 5 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min; 再分别加入 Buffer 5 μL，dNTP 1. 25 μL，ＲNA 酶抑制剂 0. 375 μL，逆转录酶 1 μL，补足水至总体积 25 μL; 42 ℃ 反应持续 60 min 终止反应; 所得产物即 cDNA，－ 80 ℃ 保存。设置内参 GAPDH 引物: 上游引物序列 5 ' -GTG CCA GCC TCG TCT CAT A-3 ' ，下 游引物序列 5 ' -GAA CTT GCC GTGGGT AGA G-3 ' ; 引物长度: 187 bp NGF 上游引物5 ' -AGT GTG TGG GTT GGA GAT A-3 ' ，下游引物: 5'- AAA GGT GTG AGT CGT GGT G-3'，引物长度: 204 bp设置PCＲ 反应体系: 2 × 荧光染料混合物 5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，cDNA 模板0. 5 μL，去 ＲNA 酶水定容至 10 μL。PCＲ 扩增反应条件为预变性 95 ℃ 10 min，变性 95 ℃15 s，退火延伸 60 ℃ 30 s，经 40 个循环; PCＲ 溶解反应条件为 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s( 0. 3 ℃ / s) ，95 ℃ 15 s。通过 2－ △Ct*终算得样品 mＲ-NA 的相对含量。
3. 4 统计学方法 采用 SPSS 20. 0 软件进行统计，计量数据采用x ±s 表示，3 组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验，P ＜ 0. 05为差异有统计学意义。
结 果
各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较 ( 表 1) 假手术组大鼠未见明显的神经功能变化。造模成功后模型组大鼠出现病灶对侧上下肢瘫痪，表现为肢体活动减少或肢体无力，多数大鼠不能直行，站立不稳，呈“划圈样”步态; 术后 6 h 模型组出现神经缺损症状，24 h 模型组神经缺损*为严重，3 d 时逐渐减轻，至第 7 d 时，神经缺损症状又进一步减轻，但行为学评分仍在 2 分以上。针刺组在 24 h 及 3、7 d 时均较模型组行为学评分减少，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05) 。
各组大鼠不同时点血肿周围脑组织 NGF 阳性细胞数比较( 表 2，图 1) 假手术组可见少量 NGF 阳性细胞表达，且在各时点无明显变化。模型组 NGF 在血肿周围开始出现表达增加，24 h、3 d 时 NGF 阳性细胞数继续增加，7 d 时达*高。从阳性细胞的形态来看，大部分为神经元细胞，胞体较大，形态较规则，** 阳性颗粒位于胞体和突起，呈均匀的棕黄色颗粒。小部分是小胶质细胞，呈圆形或椭圆形，形态不规则，阳性颗粒位于细胞胞质。与假手术组比较，模型组各时点 NGF 阳性细胞数增多，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05) ; 与模型组比较，针刺组 24 h 及 3、7 d 时NGF 阳性细胞数均增多，差异亦有统计学意义(P ＜ 0. 05) 。
各组大鼠不同时点血肿周围脑组织 NGF mＲ- NA 表达量比较( 表 3) 取 GAPDH 作为内参。脑出血后 6、24 h 及 3、7 d，假手术组大鼠 NGF mＲNA 表达量未见明显变化; 脑出血后 6 h，模型组 NGF mＲNA 表达量开始升高，24 h 达*高，后开始降低，至 7 d 时*低。与假手术组比较，模型组各时点 NGF mＲNA 表达均上调，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05) ; 针刺组 24 h 及3、7 d 时，NGF mＲNA 表达量均上调，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05) 。