丙戊酸对颅脑损伤大鼠海马成体神经干细胞原位激活的作用
杨伟锋1 ，金保哲2 ，张新中2 ，王 磊1 ，周文科2 ，王仲伟2
( 1． 新乡医学院 2013 级硕士研究生，河南 新乡 453003;
2． 新乡医学院**附属医院神经外科，河南 卫辉453100)
摘要:目的观察丙戊酸( VPA) 对颅脑损伤后大鼠海马成体神经干细胞( NSC) 原位激活的作用。方法将成年健康Sprague-Dawley 雄性大鼠 66 只随机分为正常对照组( n = 6) 、单纯损伤组( n = 30) 和VPA **组( n = 30) ，正常对照组大鼠不做任何处理，单纯损伤组及 VPA **组大鼠建立闭合性颅脑损伤模型; VPA **组大鼠按每天300 mg·kg － 1 的剂量经腹腔注射给药进行干预，单纯损伤组大鼠给予腹腔注射等量的生理盐水进行干预，分别于颅脑损伤后 3、7、14、21、28 d 断头取脑标本，采用**荧光技术检测各组大鼠不同时间点海马齿状回内 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷( Edu) 阳性细胞数及大鼠海马齿状回内巢蛋白( Nestin) 阳性细胞数的变化。结果 单纯损伤组和 VPA **组大鼠海马齿状回内 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数于造模后第 3 天开始增高，于造模后第 21 天达高峰， 在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组大鼠 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数均高于正常对照组( P ＜ 0． 01) ，而 VPA **组各时间点 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P ＜ 0． 01) 。结论 丙戊酸对颅脑损伤大鼠海马成体 NSC 有原位激活作用。
关键词:创伤性颅脑损伤; 丙戊酸; 大鼠; 神经干细胞
中图分类号: Ｒ394． 2 文献标志码: A 文章编号: 1004-7239( 2016) 06-0469-04
丙戊酸( valproic acid，VPA) 是目前临床一线广谱抗癫痫药，在预防和控制癫痫发作中发挥着主要 作用。VPA 是分子量很小的短链脂肪酸，由 8 个碳原子和脂肪酸支链组成，能很好地透过血脑屏障。近年来有研究表明，VPA 在**脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统**中有显著疗效［1-4］。作者通过制作重型颅脑损伤大鼠模型，造模成功后给予 VPA 进行干预，于不同时间点取材测定颅脑损伤大鼠脑组织中 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷( 5-e- thynyl-2'- deoxyuridine，Edu) 细胞及巢蛋白( Nestin)阳性细胞的表达及其动态变化，观察 VPA 对颅脑损伤大鼠海马成体神经干细胞( neural stem cell，NSC)的原位激活作用。
1 材料与方法
1． 1 实验动物 健康清洁级成年 Sprague-Dawley ( SD) 雄性大鼠 66 只，体质量 250 ～ 300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号: SCXK ( 京 ) 2012-0001， 质 量 合 格 证 号 : 114。
1． 2主要试剂及仪器 鼠自由落体打击器( 北京智鼠多宝生物科技有限公司) ，Edu 组织切片试剂盒 ( 美国 Gene Copoeia 公司) ，VPA ( 北京百灵威科技有限公司) ，Nestin 单克隆抗体( 英国 Abcam 公司) ，羊抗鼠荧光二抗、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚( 4'，6- diamidino-2-phenylindole，DAPI) 染色反应液( 美国 Gene Copoeia 公司) ，BM-IX 型生物组织包埋机( 孝感市宏业医用仪器有限公司) ，Shan Don Finesse 325型石蜡切片机( 美国 Thermo 公司) ，**荧光显微镜( ECLIPSE 55i，日本 Nikon) 。
1． 3动物分组及模型制备 健康清洁级成年 SD雄性大鼠 66 只，随机分为正常对照组( n = 6) 、单纯损伤组( n = 30) 和 VPA **组( n = 30) 。正常对照组大鼠不做任何处理; 单纯损伤组、VPA **组大鼠以 Feeney 方法［5-6］制作颅脑损伤模型。将大鼠置于底座，固定头部。质量分数 10% 水合氯醛麻醉， 剪去大鼠顶枕部毛发，常规**，在顶枕部的中线偏 右约 5 mm 处纵行切约 4 cm 切口，钝性剥离软组织和骨膜，充分暴露颅骨。在人字缝前 3 mm、颅骨中线旁 3 mm 处，钻一直径约 5 mm 的圆形骨孔，可见硬脑膜，注意保护其完整完好。大鼠自由落体打击 器以 25 g 打击锤从 20 cm 的高处自由落体打击，造成大鼠闭合性颅脑损伤，成功后骨蜡封闭骨破损区， 缝合头皮。术后 VPA **组大鼠给予腹腔注入VPA，按每天 300 mg·kg － 1 的剂量经腹腔注射给药，连续给药至处死当天; 单纯损伤组大鼠术后经腹腔给予等量的生理盐水; 术后将大鼠分笼饲养在动物专用饲养室。
1． 4 造模大鼠行为学评分及入组标准 参照大鼠神经功能评分( neurological severity scores，NSS) ［7］于术后第 1、4、7、14、21、28 天对各组大鼠神经功能进行评分。包括运动、感觉、反射及平衡能力 4 项， *高 18 分，*低 0 分。轻度损害: 1 ～ 6 分，中度损害: 7 ～ 12 分，重度损害: 13 ～ 18 分。入组标准为术后第 1 天评分 5 ～ 15 分。
1． 5取材与制片 按分组给予 Edu 标记( 参照说明书) : 采用生理盐水溶解 Edu 至 0． 5 g·L － 1 ，按照 50 μg·kg － 1 每只大鼠尾静脉注射 20 μL，连续注射 2 d。将单纯损伤组及 VPA **组大鼠分别在造模后第 3、7、14、21、28 d 分别取 6 只大鼠，质量分数10% 水 合 氯 醛 麻 醉，先 用 肝 素 化 生 理 盐 水10 U·mL － 1 快速灌注，然后换 40 g·L － 1 多聚甲醛灌注，至 肢体抽搐，断 头取脑，冲 xi脑表面积血， 40 g·L － 1 多聚甲醛固定过夜，以视交叉为中心向后取 2 mm 厚的冠状脑片，充分固定后常规脱水、透明、石蜡包埋，用石蜡切片机制作厚5 μm 冠状切片，每个标本取 3 张片，行 Edu 及Nestin **荧光染色［8］。
1． 6 Edu 及 Nestin **荧光染色 采用 Edu 组织切片试剂盒进行 Apollo 染色，严格按照说明书进行操作，然后滴加 100 μL 1 × DAPI 染色反应液，避光，室温孵育 30 min 后，弃染色反应液，无菌磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗 1 ～ 3 次，洗脱 DAPI 反应液，检测 Edu 阳性细胞。采用柠檬酸盐抗原修复液进行抗原修复后，PBS 清洗 1 ～ 3次，山羊血清 37 ℃ 封闭 30 ～ 60 min，抗 Nestin 抗体 1∶50 稀释成工作浓度后孵育一抗，37 ℃ 作用30 min，0． 01 mol · L － 1 磷酸盐吐温缓冲液( phos- phate buffered saline with tween-20，PBST) 缓冲液震荡漂洗 3 次，每次 5 min ，加 1∶1 000 羊抗鼠荧光二抗，37 ℃ 湿盒避光作用 30 min，0． 01 mol·L － 1 PBST避光漂洗 3 次，每次 5 min，甘油缓冲液封片。在显微镜上同一视野内分别用 488 nm 和 555 nm 波长进行激发检测。荧光显微镜下观察各组海马区齿状回 阳性细胞数，每只大鼠随机选取海马齿状回区各 3 张切片，每张切片每高倍镜下计数 5 个视野并拍照， 取其均值作为阳性细胞数［9］。
1. 7 统计学处理 应用 SPSS 19． 0 对数据进行处理，计量资料以均数 ± 标准差( x珋± s) 表示，采用析因的方差分析进行检验，组间比较用 LSD 检验方法， 检验水准 α = 0． 05。
2 结果
1 3 组大鼠脑组织齿状回 Edu 阳性细胞比较结果见图 1 和表 1。单纯损伤组和VPA **组大鼠海马齿状回内Edu 阳性细胞数于造模后第3 天开始增高，于造模后第 21 天达高峰，在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组大鼠 Edu 阳性细胞数均高于正常对照组( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **组大鼠各时间点 Edu 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P ＜ 0. 01) 。
2． 2 3 组大鼠脑组织齿状回 Nestin 阳性细胞比较结果见图 1 和表 1。单纯损伤组和VPA **组大 鼠海马齿状回内 Nestin 阳性细胞数于造模后第 3 天开始增高，于造模后第 21 天达高峰，在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组 Nestin 阳性细胞均高于正常对照组( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **组大鼠各时间点 Nestin 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P ＜ 0. 01) 。
3 讨论
动物实验研究证明，颅脑损伤后可诱导海马齿 状回等部位内源性 NSC 的分裂增殖，且多数可分化为成熟颗粒神经元［10-11］。但这种由创伤诱导的神经干****往往不能改善脑外伤所造成的损害。VPA 作为组蛋白去乙酰化酶( histon deacetylaseHDAC) 抑制剂，对**神经系统损伤后局部炎症反应有抑制作用 。近年来，有研究表明，无论在体外还是在体内，VPA 均具有保护细胞和抗细胞凋亡的作用［12］。
Edu 是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶( T) 渗入正在复制的 DNA 分子中，通过基于 Edu 与 Apollo 荧光染料的特异性反应快速检测细胞 DNA 复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA 修复、病毒复制、细
胞标记示踪等方面的研究。与传统的 5-溴脱氧尿嘧啶核苷相比，其分子量小，更容易穿过细胞膜，能 有效在组织间进行渗透，从而实现快速处理组织和 器官的切片标本，而且在检测时不需要对标本进行 变性处理，不会出现因变性引起 DNA 结构改变，因此，有效保证了 DNA 结构的完整性［13-15］，增加了检测的灵敏度和准确度。Nestin 属于胚胎性第Ⅵ类中间丝蛋白，主要定位于细胞基质内，在**神经系统 发育中仅在胚胎期表达，出生后即停止表达［16-17］; 未分化和具有分裂能力的神经前体细胞内有丰富的Nestin 阳性表达，随着其向神经元和神经胶质细胞的进一步分化，Nestin 的表达即逐渐降低，而被星形胶质细胞标志物即胶质纤维酸性蛋白、波形蛋白或 神经丝所替代。而颅脑损伤可引起成体脑内 NSC 增殖，表现为 Nestin 表达增高，所以多将 Nestin 用于鉴定损伤后**神经系统内 NSC 的增殖变化［16-17］。因此，本实验以 Edu 和 Nestin 作为观察指标来研究VPA 对大鼠颅脑损伤后海马齿状回 NSCs 增殖变化的影响。
本实验应用 VPA 作用于颅脑损伤大鼠，于不同时间点观察 Edu 及 Nestin 阳性细胞的表达情况。实验结果显示，应用该**后 Edu 及 Nestin 阳性细胞数与正常对照组及单纯损伤组比较明显增加; VPA **组大鼠 Edu 及 Nestin 阳性细胞数在应用VPA 3 d 后比单纯损伤组稍有增加，之后增加渐趋明显，至第 21 天达高峰，28 d 与 21 d 比较不再增加。从而说明 VPA 对颅脑损伤大鼠海马成体 NSC 有原位激活作用，在颅脑损伤前 21 d 应用该药对NSC 的激活作用明显，之后作用逐渐减弱，这为临床用药时间窗的确定提供了参考依据。另外，从实验 中也可以看到，颅脑损伤后不管是单纯损伤组还是VPA **组，海马齿状回 Edu 及 Nestin 阳性细胞数均比正常对照组大鼠明显增加，这说明颅脑损伤对 大鼠海马成体 NSC 也有原位激活作用，而且 VPA 与颅脑损伤有协同作用，共同促进大鼠海马成体NSC 原位激活的作用。但 VPA 促进 NSC 增殖的具体机制以及其动态迁移的过程尚不清楚，还有待于 进一步的系统研究。