肺缺血再灌注损伤模型犬接受去氢骆驼蓬碱干预后无明显肺保护作用
张皓，齐海，李元明，陈家骅(新疆医科大学**附属医院胸心外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830063)
文章亮点：
1 实验采用犬肺常温缺血再灌注模型，进行热灌注肺保护液，在国内同类研究中较为少见。
2 有研究表明，去氢骆驼蓬碱有一定的抑制炎症反应、抗氧化的作用。文章率先通过分析细胞因子水平、肺
湿/干质量比、肺动脉压力等实验指标探讨去氢骆驼蓬碱对肺的保护作用，具有一定的**性。
3 实验选择短时间常温缺血再灌注放大了同等时间冷缺血再灌注损伤，具有节省实验时间、实验动物易于耐
受、模型建立操作方便的效果。
关键词：
实验动物；组织构建；去氢骆驼蓬碱；低钾右旋糖酐液；缺血再灌注；损伤；肺；常温；动物模型
主题词：
模型，动物；再灌注损伤；肺；右旋糖酐类；哈尔明
摘要
背景：
炎性细胞活化、氧自由基的产生是肺缺血再灌注损伤发生的重要因素。在常用的肺保护液中增加可能具有抑制炎症、抗氧化作用的**，使保护液进行一定的改良，对肺缺血再灌注损伤的研究及保护移植肺的功能具有重要的意义。
目的：
探讨去氢骆驼蓬碱对犬肺缺血再灌注损伤的作用。
方法：将 12 只健康杂交犬随机分为两组，每组 6 只。建立犬肺缺血再灌注损伤模型，采用顺灌方式行保护液肺灌注，实验组给予低钾右旋糖苷保护液+去氢骆驼蓬碱溶液灌注，对照组给予低钾右旋糖苷保护液。缺血2 h 后，恢复左肺循环，两组于再灌注后采集左肺组织及血液标本，检测细胞因子水平，计算肺湿/干质量比； 收集支气管肺泡灌洗液，观察各项病理指标；连续测量记录主肺动脉压、左肺动脉压和右肺动脉压。
结果与结论：
两组于再灌注 2，4 h 时左肺组织及血液中的白细胞介素 17、肿瘤坏死因子 α 及内皮素 1 水平差异均无显著性意义(P> 0.05)，两组再灌注 4 h 后的支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、**细胞数目、肺泡损伤指数及血管壁水肿程度差异均无显著性意义(P> 0.05)，两组肺湿/干质量比差异均无显著性意义(P> 0.05)，经方差分析，两组主肺动脉压、左肺动脉压及右肺动脉压差异均无显著性意义(P> 0.05)。结果可见通过对细胞因子、病理指标、肺组织湿/干质量比及肺动脉压力分析，去氢骆驼蓬碱在犬肺原位常温缺血再灌注损伤模型中没有明显的肺保护作用。
张皓，齐海，李元明，陈家骅. 肺缺血再灌注损伤模型犬接受去氢骆驼蓬碱干预后无明显肺保护作用[J].中国
组织工程研究，2014，18(36):5805-5812.
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引言
Introduction
随着医学技术的发展，器官移植在临床上成为了现实和可能。肺移植对于终末期肺部**是一种有效的**方法[1]，然而，肺缺血再灌注损伤的出现，成为早期移植肺失败的主要原因，导致移植后发生原发性移植肺功能障碍[2]。肺缺血再灌注损伤是某种原因使肺组织遭受一定时间的缺血，恢复血液灌流(再灌注)后，缺血、缺氧引起的肺损伤没有减轻，反而加重的病理现象[3]。它常见于肺移植、肺叶切除、体外循环等，尤其在肺移植手术中发生率*高[4-6]。因此，减轻肺缺血再灌注损伤以及阐明其发病机制已经成为亟待解决的难题。多年来，针对如何减轻肺缺血再灌注损伤进行了大量的实验和临床研究，但极少具有应用价值[7]。研究证实，目前*为有效、稳定的办法是行保护液肺灌注。常用的肺保护液分两类，一类是细胞内液型(高钾低钠)保护液，以EC(Euro-Collins)液为代表；另一类为细胞外液型(低钾高钠)保护液，以低钾右旋糖酐(LPD)液为主。1991年，第2 届国际终末期肺**移植会议明确EC液作为临床肺保护液[8]。但学者们对两类不同保护液的肺保护作用看法不一，大多数认为：细胞内液型保护液含有高浓度K+ ，可抑制血管内皮细胞及平滑肌细胞膜内K+ 外流，导致细胞膜静息电位的**值减小，易使细胞膜外Na+内流，引起细胞膜去极化、发生动作电位，触发Ca通道开放、Ca2+向膜内流动，造成平滑肌细胞收缩、内皮细胞释放内皮素，从而导致血管收缩，增加肺循环阻力和促进肺部水肿，进而加重肺损害。而含有低浓度K+的低钾右旋糖酐液无此现象[9]。对于K+ 浓度的适宜性问题，Bando等[10]和Muller等[11]进行了深入研究，证实了细胞外液型保护液优于细胞内液型保护液，提出了灌注液K+的浓度不应太高也不应太低，*适宜在20-40 mmol/L。除此之外，低钾右旋糖酐液在保护肺泡上皮功能和内皮细胞新陈代谢方面与EC液比较也有一定的优势[12]。Gamez等[13]通过临床研究报道，在肺移植后早期恢复阶段，低钾右旋糖酐液可以明显降低约50%的肺缺血再灌注损伤发生率。因此对于肺保护来说，特别是在早期移植物功能的保护方面，细胞外液型保护液较细胞内液型更有应用价值[14]。现今，临床**和实验研究中多使用低钾右旋糖酐液作为肺保护液的优选，除低浓度钾对血管有保护作用外，还认为含有的葡萄糖可以为细胞供能以及增加能量储备，提高移植肺的功能。Chu等[15]提出，在保护液中添加其他保护成分比单纯使用肺保护液更有价值。如有学者报道在低钾右旋糖酐液中增加参附注射液、谷胱甘肽、西地那非等，都取得了较好的肺保护效果。因此在肺保护液中添加**成分，对其进行改良，成为减轻肺缺血再灌注损伤研究的重点和方向。
去氢骆驼蓬碱又称为哈尔明碱(harmine，HM)，为β-咔啉类生物碱，是植物骆驼蓬种子中的主要成分[16-17]。近几年，不少学者对去氢骆驼蓬碱的药理作用进行了研究，得出不同的结论。Khan等
[16]发现去氢骆驼蓬碱对用肾上腺素和氯化钾溶液处理后收缩的大鼠离体胸部大动脉有血管舒张作用，其机制与促进血管内皮细胞释放血管舒张因子及微弱的与Ca2+通道结合，非竞争性抑制Ca
2+内流作用有关。Berrougui等[18]研究认为骆驼蓬碱能够舒张血管，去氢骆驼蓬碱则无此作用。Moura等[19]研究提出去氢骆驼蓬碱可以作为活性氧的**剂。Chen等[20]及Yamazaki等
[21]研究发现去氢骆驼蓬碱可以抑制肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶的产生，来发挥**作用。
Bi等[22]通过小鼠实验发现去氢骆驼蓬碱能够减轻肠系膜缺血再灌注损伤，提出活性氧增多和炎性细胞活化在缺血再灌注损伤中扮演重要角色，认为β-咔啉类生物碱具有潜在的抗氧化能力。
目前国内外文献报道中，尚未见有关去氢骆驼蓬碱对肺缺血再灌注损伤作用的研究。本实验对低钾右旋糖酐液进行改良(加入去氢骆驼蓬碱液)，以犬模拟临床肺移植过程中出现的肺缺血再灌注损伤，通过观测白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1、肺泡损伤指数、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及**细胞数目、肺湿/干质量比、肺动脉压等实验指标，探讨去氢骆驼蓬碱对犬肺缺血再灌注损伤的影响及可能机制。
1材料和方法 Materials and methods
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2009年9月至2012年11月在新疆医科大学**附属医院外科实验中心完成。
材料：
实验动物：
健康成年杂交犬12只，雌雄不限，体质量 20-31 kg，平均(27.333±3.339) kg，犬龄12-16个月，平均(13.668±1.435)个月，由新疆医科大学**附属医院外科实验中心提供。实验前1周进行动物观察，手术前给予禁食12 h，禁水4 h。12只犬的体质量、性别、年龄经统计学分析差异无显著性意义。该实验方案经过新疆医科大学**附属医院实验动物伦理委员会审查并批准，所有实验动物得到了人道关怀。
实验方法：
实验分组：对实验犬依次编号(1-12号)，按照随机排列表方法将12只犬分为实验组和对照组，每组6只。实验组为低钾右旋糖苷+去氢骆驼蓬碱保护液灌洗组；对照组为低钾右旋糖苷保护液灌洗组。
建立犬肺原位常温缺血再灌注损伤动物模型：
①术前 准备：室温27℃，呼吸机、心电监护仪安放于手术台一侧， 手术器械摆放在手术托盘上，犬禁食12 h，禁水4 h。②麻 醉处理：实验犬肌注阿托品，静脉给予芬太N(10 μg/kg)、 丙泊酚(2 mg/kg)进行**麻醉。麻醉起效后，取仰卧位、备皮，四肢固定于手术台上。插导尿管接尿袋，**管插管接呼吸机，机械通气：潮气量15-20 mL/kg，频率20次/min， 氧浓度为60%。行持续心电监测，于左或右侧颈外静脉处插管，给予生理盐水溶液滴注维持。③手术操作：备皮区碘伏**3遍，铺无菌巾。选择双侧第4或第5肋间，作横行切口，离断胸骨进入胸腔。纵行切开心包并悬吊(左侧部 分悬吊)，解剖肺动脉主干及左右各支、左右肺静脉上中下各支及左主支气管并充分游离、暴露。主肺动脉近心端插入测压管，荷包缝合固定，持续记录犬主肺动脉压、左右肺动脉压(测定时阻断对侧)，采用间歇测定法，每30 min/次。 左肺动脉远心端置入灌注管，荷包缝合固定。测压管、灌注管内推注低分子肝素钠(1 mL/kg)。阻断前左肺充气膨胀，右肺动脉绕带备阻断。用阻断钳夹闭左肺动脉近心端，直角钳阻断左主支气管，缝线结扎左肺**管及左侧支气管动静脉。左肺上中下叶静脉近心端阻断，远心端造口。从左肺动脉灌注管内灌注37 ℃保护液，压力维持在18 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，灌洗量以60 mL/kg计算，采用顺灌方式进行。实验组予低钾右旋糖苷保护液+去氢骆驼蓬碱溶液灌注，对照组予低钾右旋糖苷保护液。左肺常温阻断2 h后，予相应灌洗液左肺血管冲洗。拔出灌注管，结扎左肺动脉荷包缝合，左肺各支静脉造口处缝线打结闭合。 *后开放左肺动脉及左主支气管，恢复左肺循环，呼吸机调整为双肺通气。④标本留取：左肺再灌注2 h后，取双侧等量肺组织，制备成肺组织匀浆标本。抽血液10 mL于抗凝试管并放置在离心机中，以转速1 500 r/min进行离心。5 min后取出试管，将上层血清吸出留取血清标本。左肺再灌注4 h后，取各犬左侧等量肺组织，用于肺组织湿/干质量比(W/D)的测定。其余标本留取方法同上。实验结束后，从气管中插入灌洗管至左肺组织，留置支气管肺泡灌洗液标本。将所有标本存放于-80℃冰箱中，以备检测。
肺组织及血液白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1的测定：将再灌注2，4 h时采集的肺组织匀浆及血液标本从-80℃冰箱中取出，运用ELISA检测试剂盒，对样品浓度进行测定。操作步骤如下：①取出酶联板，设立空白孔、标准孔及待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，标准孔加标准品100 μL，待测样品孔加实验标本100 μL。②每孔加检测溶液A、B工作液100μL，酶标板加上覆膜，在37 ℃电热恒温培养箱内反应60 min。③温育60 min后，弃 去孔内液体，甩干并洗板。④每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜，在37 ℃环境下避光显色。⑤每孔加终止溶液 50 μL，进行终止反应，即蓝色变为黄色。⑥用酶联仪在450 nm波长下进行比色，计算吸光度值。⑦得出数值后， 在电脑上运用软件(curve expert 1.3)绘制曲线，对白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平进行计算分析。
