A型肉毒**对膝骨性关节炎大鼠模型镇痛效果及机制的实验研究（上）
马文俊1 梁 英2，3
摘要
目的：评估A 型肉毒**(BTX-A)在骨性关节炎模型中的镇痛效果及疼痛相关物质在脊神经节的变化，为其临床**骨性关节炎疼痛提供科学的理论依据。
方法：SD 大鼠右膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml 建立膝骨性关节炎(KOA)的动物模型。造模成功的大鼠于第2 天随机分为2 组：BTX-A 组(n=10)：关节腔内注射5μl BTX-A 0.1IU；WFI 组(n=10)：关节腔内注射5μl 注射用水；Sham 组(n=10)：非关节炎模型组。注射后第1、3、5 天后检测疼痛行为学、热痛阈，**组织化学检测脊神经节钠离子通道1.8(Nav1.8)蛋白的表达。
结果：自发疼痛行为分析显示大鼠骨性关节炎引起步态异常，与WFI 组相比，BTX-A 组的大鼠异常步态改善明显，注射后5 天与1、3 天相比较，自发疼痛行为改善的愈明显；BTX-A 组大鼠右足热痛阈升高(P<0.05)，脊神经节Nav1.8蛋白表达下调(P<0.05)。
结论：关节腔内注射BTX-A 可能通过下调脊神经节Nav1.8 蛋白的表达，减少**致敏，减轻关节疼痛，提高痛阈，从而起到镇痛作用。
关键词 A 型肉毒**；膝骨性关节炎；钠离子通道1.8；热痛阈；镇痛
中图分类号：R684 文献标识码：A 文章编号：1001-1242(2017)-06-0649-05
DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2017.06.008
*基金项目：山西省课题基金（201301055）
1 山西医科大学附属**临床医学院，山西太原，030001；2 山西医学科学院，山西大医院；3 通讯作者作者简介：马文俊，男，硕士研究生，住院医师；收稿日期：2015-04-06
膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以滑膜和关节软骨结构破坏为主要病理改变的慢性退行性的关节**[1]，发病率高，临床表现为关节疼痛、活动受限，严重影响生存质量。目前**骨性关节炎的方法很多，如口服止痛剂、关节腔内注射皮质类固醇**或玻璃酸钠、关节镜清创术及关节置换，存在****反应[2]、效果持续时间不稳定，或高手术风险的代价[3]，因此急需**关节炎的**、有效的方法。
KOA 伴随关节软骨的损害及膝关节炎性介质的释放增加，这些外周伤害性刺激的不断的输入将调控脊髓的痛觉传递神经元，通过痛觉过敏及**敏化机制，导致神经元突触的兴奋性增加和痛阈下降。脊神经节是疼痛信号传导的**级神经元，且Nav l.8 特异性表达在脊神经节，激活其动作电位可使痛觉上传。KOA 突出表现为关节疼痛，其疼痛的主要机制之一是脊髓中疼痛传导递质Nav l.8 的过度表达，使患者对疼痛的敏感度增高。研究表明，A 型肉毒**（botulinum toxix type A, BTX-A）对神经病理性疼痛具有较好的止痛作用，但对膝骨性关节炎的镇痛效果和镇痛机制，尤其脊髓水平镇痛机制的研究尚缺乏相应的报道。目前已有临床研究观察到对老年慢性KOA 患者关节腔内注射A型肉毒**有减轻疼痛的作用，延缓KOA 的进展，但其镇痛机制尚不明确，缺乏理论支持，故临床应用受到制约。本研究拟在大鼠骨性关节炎模型中，通过关节腔注射A 型肉毒**，观察其对大鼠膝骨性关节炎的镇痛效果，并观察脊髓背角中钠离子通道Nav l.8 的表达的变化， 从**敏化角度部分阐明其镇痛机制，达到改善膝骨性关节炎疼痛及**其**有效方法的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
SD 大鼠，均为雄性，清洁级，体质量(150±30)g， 购自山西医科大学动物实验中心。木瓜蛋白酶，购自天津药业集团新郑股份有限公司，试剂号9001-73- 4。注射用BTX-A，购自兰州生物制品研究所，批号20140609。兔抗大鼠 Nav1.8、FITC 标记山羊抗兔IgG 均购自太原市贝倍科贸有限公司；电动跑步机购自北京东西仪科技有限公司；鼠爪热辐射刺激测痛仪购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。
1.2 方法
参照Panicker 等[4]的建模方法建立实验模型，固定大鼠使右膝关节屈曲90°，乙醇**并充分暴露，于膑韧带外侧0.2cm 凹陷处进针，出现落空感，回抽无血液后注入4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml，注射完毕后再次**且反复活动膝关节。于第1、4、7 天分别进行注射。自注射之日起每日上、下午分别驱赶动物活动两次，每次10min，以使大鼠于规定时限内运动不停歇为标准，连续7 日。
将SD 大鼠随机分成3 组，每组10 只：其中两组是骨性关节炎组，分别给予BTX-A 和WFI。BTX-A 组：用 30 号针头穿刺 2.5mm，膝关节内注射 5μl 的 BTX-A 0.1 IU；WFI 组：膝关节内注射 5μl 注射用水；Sham 组为非关节炎大鼠。
1.3 检测指标
1.3.1 行为学测试：自发疼痛行为步态分析：肉眼步态分析观察大鼠在 17cm/s 的电动跑步机上行走20s。在0—4 分之间半定量分析大鼠的步态。0 分： 大鼠拒绝在跑步机上行走；1 分：大鼠行走了规定时间的30%，步态表现为严重的不协调；2 分：大鼠行走了规定时间的60%，步态表现为中等的不协调；3分：大鼠行走了规定时间的90%，期间没有触碰间隔物、跳跃、张腿或拖后腿，步态表现为轻微的不协调； 4 分：大鼠行走完了规定时间，期间没有触碰间隔物、跳跃、张腿或拖后腿。
热刺激撤足阈值(paw withdrawal latency PWTL)的测定：利用鼠爪热辐射刺激测痛仪检测大鼠后肢足跟部皮肤对热刺激的反应。测试前将大鼠放置于测痛仪的有机玻璃罩内自由活动约5min，测试时将热辐射光源通过透明玻璃板输出热刺激并聚焦于大鼠后肢足掌部。调整好仪器刺激强度(IR= 72)，按下操作开始键，热源启动并缓慢施加热刺激，在大鼠鼠爪撤足的瞬间手动记录大鼠反应时间，此时间即为大鼠足底部的热刺激撤足潜伏期(**度达0.1s)，即热痛阈。为避免长时间热刺激造成组织损伤不宜热刺激时间超过25s。以5min 的间隔对双侧后足各测3 次，3 次撤足潜伏期的均值为所得数据。
1.3.2 **荧光组织化学检测：用10%水合氯醛(4 ml／kg)麻醉大鼠后，行4%多聚甲醛经心脏灌流术固定，取出 L5 背根神经节，4%多聚甲醛浸泡固定 24h(4℃)。组织经乙醇梯度脱水，石蜡包埋，厚4μm 石蜡切片。切片晾干后，经二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗，PBS 溶液冲洗，脊神经节滴加Nav1.8 一抗后 4℃过夜；次日用 dH2O、磷酸盐缓冲液(PBS) 各洗 5min，滴加羊抗兔FITC，室温过夜(注意避光)，次日荧光显微镜观察，在激发光波长为490nm、滤色光波长为520nm 条件下拍照。
1.4 统计学分析
全部数据应用SPSS 20.0 统计软件进行处理， 行为学测试结果采用非参数秩和检验进行分析。同一组大鼠不同测试时间点的数据用相关样本参数检验分析；采用均数±标准差表示计量资料，用t 检验及方差分析对计数资料进行分析，P<0.05 为有显著性意义。
2 结果
2.1 膝骨性关节炎模型
在大鼠右膝关节内注射 4% 木瓜蛋白酶溶液0.3ml，实验第5 天80%大鼠已有不同程度出现关节肿胀及活动受限，7d 达到高峰。取20 只自发疼痛行为步态分析阳性(评分为1 分）及关节肿胀的大鼠。
2.2 自发疼痛检测结果
自发疼痛检测阳性的20 只大鼠分为两组，在右侧膝关节内分别注射BTX-A 组(n=10)：5μl 的BTX- A0.1 IU，WFI 组(n=10)：5μl 的注射用水，分别在注射后1 天、3 天及5 天进行自发痛检测。与WFI 组相比，BTX-A 组的大鼠自发疼痛行为改善明显，差异有显著性意义(P=0.002<0.05)。膝骨性关节炎大鼠在注射BTX-A 后1 天、3 天及5 天，分别进行自发疼痛步态分析的检测。注射BTX-A 后时间不同，自发疼痛行为改善也不同，差异有显著性意义（P< 0.05）。注射BTX-A 后1、3、5 天，三组中两两相比较均有显著性差异（P<0.05），且随着注射后时间延长 (≤5 天），自发疼痛步态改善越明显。
2.3 热痛阈检测结果
2.3.1 三组大鼠：Sham 组、关节炎+WFI 组、关节炎+ BTX-A 组分别在注射后第1、3、5 天测试大鼠右足热痛阈值。在实验观察的时间内，关节炎+WFI 组与Sham 组比较，PWTL 均有所降低（P<0.05，见表1)。
2.3.2 热痛阈结果显示：模型组大鼠第 1 天给予BTX-A 注射后24h 大鼠的热痛阈值即明显上升（P< 0.05，见图1），且随时间的延长其缓解疼痛效果逐渐明显，一直可持续到注射后第5 天（P<0.05，见图1），与注射用水组比较，BTX-A 组热痛阈明显高于对照组（P<0.05，见表1）。实验结果表明注射BTX-A 可缓解疼痛，增加热痛阈值。
2.4 脊神经节Nav1.8 的表达
**荧光组织化学结果显示WFI 组可上调DRG（背根神经节）神经元中Nav1.8 蛋白表达水平（见图2），与假手术组比较，有显著性意义（P<0.05， 见表 2）。BTX- A 注射 5 d 后大鼠 DRG 神经元中Nav1.8 蛋白表达上调现象被明显抑制（见图2），与注射用水组比较，具有显著性意义（P＜0.05，见表 2）。结果提示BTX-A 干预后可下调大鼠DRG 神经元中原本表达增多的Nav1.8 蛋白。
