厄贝沙坦、阿司匹林单独及联合作用对MCA鼠模型脑损伤影响的观察
李春华1，王晓东2，朱予津2，王 正2，严子平2，刘长胜2
（武警天津总队医院：1.内科；2.药械科，天津 300162）
摘 要：【目的】利用MCAO 模型大鼠研究厄贝沙坦（IRB）、阿司匹林（ASP）在脑卒中后对脑组织的影响。【方法】雄性Wistar 大鼠40 只随机分为5 组：MCAO，IRB+MCAO，ASP+MCAO，IRB+ASP+MCAO，正常对照。连续给药7 d 后，I-IV 组行MCAO 术，24 h后观察行为、梗塞容积、生化指标，SPSS16.0 处理实验数据。【结果】预防性给予IRB、ASP 的大鼠与单纯MCAO 大鼠比较，自发活动率、抓力、过氧化氢酶水平呈上升趋势，梗塞容积、TBARS 水平呈下降趋势（P＜0.05）。【结论】IRB 与ASP 有改善脑卒中后脑损伤的作用，联合用药效果更为显著。
关键词：脑卒中；MCAO 大鼠模型；厄贝沙坦；阿司匹林
【文章编号】2095-3720(2013)04-0252-04 【中图分类号】R965 【文献标志码】A
脑卒中是严重危害人类健康和生命**的常见的难治性**［1］，存在着明显三高（发病率高、致残率高、死亡率高）现象，已得过脑卒中的患者，还易再复发，每复发一次，加重一次。所以，急需采取有效措施预防脑卒中的发生。厄贝沙坦（Irbesartan，IRB）为血管紧张素Ⅱ受体抑制剂，能特异性地拮抗血管紧张素转换酶1 受体，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用［2］。阿司匹林（Aspirin，ASP）是一种抗风湿历史悠久的解热镇痛药，具有解热、镇痛、**、抗风湿和抗血小板聚集等多方面的药理作用［3］。本实验拟通过观察大鼠的行为、梗塞容积、生化指标来了解IRB 与ASP 降低脑卒中后脑损伤的效果，并探讨联合用药是否具有事半功倍的疗效。
1 资料与方法
1.1 一般资料
药品及试剂：IRB（上海雅吉生物科技有限公司，100 mg），ASP（上海恒远生物科技有限公司，200 mg），0.5%CMC-Na、SDS（任丘市华燕化工产品有限公司）。TBARS 试剂盒（SAT-330），过氧化氢酶试剂盒（SAT-341）购于Cell Biolabs Inc。
1.1.1 仪器：MCAO 线（2636-50，北京沙东生物技术有限公司），自发活动视频分析系统和大小鼠抓力测定仪（DB018，DB025，北京智鼠多宝生物科技有限责任公司），病理图像分析仪（DMR+Q550，德国莱卡），酶标分析仪（Thermo Scientific Multiskan FC 酶标 仪 ，美 国 赛 默 飞 世 尔），转 膜 仪（Bio-rad Trans-Blot，美国伯乐）。
1.1.2 动物：健康雄性清洁级Wistar 大鼠由**科学院实验动物中心提供，体重250~300 g，笼养，动物质量合格证书编号SCXK-（军）2002-001。
1.2 方 法
1.2.1 实验分组及给药：将大鼠随机分为5 组，每组8 只。第 1 组，建立单纯右侧大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO) 模型，灌胃0.5%CMC 溶液5 ml；第2 组建立MCAO 模型之前灌胃给予IRB（IRB 按 0.04 g/ml 溶于 0.5% CMC-Na 溶液）5 ml；第3 组，建立MCAO 模型之前灌胃给予ASP（ASP 按0.08 g/ml 溶于0.5% CMC-Na溶液）5 ml；第4组，建立MCAO 模型之前给予IRB+ASP（体积各半） 5 ml；第 5 组为正常对照组灌胃 0.5% CMC 溶液 5 ml。定时经口腔灌饲液体，1 次/d，连续7 d。*后一次给药3 h 后第1~4 组建立MCAO 模型，建模2 h 后恢复灌注22 h，随即监测自发活动与握力，然后处死大鼠，取出脑组织检测梗死容积、TBARS、过氧化氢 酶水平。
1.2.2 MCAO模型制备：大鼠麻醉（水合氯醛400 mg/ kg，经腹腔注射）后仰卧位固定于手术台上，行颈前正中切口分离并暴露右侧颈总动脉，再向头端分离出颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉，并分离出颈内动脉颅外段分支翼腭动脉，夹闭其近端。在颈外动脉根部剪口，将MCAO 线经颈外动脉逆向插入颈内动脉，到达大脑前动脉近端，作为栓塞成功标记［4］。
1.2.3 自发活动率和抓力测量：利用自发活动视频分析系统和大鼠抓力测定仪对大鼠逐一进行自发活动与抓力测试。
1.2.4 梗塞容积计算：将大鼠断头取脑并速冻后自视交叉向后作厚约2 mm 的连续切片6 片，置于2％ 氯代三苯基四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride，TTC）缓冲液中，37℃避光孵育30 min。采用病理图像分析仪的软件分析系统计算每张冠切片的脑梗塞面积，根据面积和切片间隔计算脑片上梗塞灶体积占全脑体积的百分比［4］，见图1。
1.2.5 硫代***酸活性物质分析（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）：PBS 溶液冲洗新鲜脑组织样本，低温下制得组织匀浆。4℃，10 000 r/min 离心 5 min，收集上清。按2：2：5 的比例依次加入样品、SDS 裂解液、TBA 稀释液。95℃水浴 50 min，冷却后3 000 r/min 离心15 min。使用酶标分析仪测定532nm 处光吸收度。
1.2.6 过氧化氢酶分析：PBS 溶液冲洗新鲜脑组织， 低温下制得组织匀浆。4℃ ，10 000 r/min 离心 15 min 收集上清，利用Western Blot 检测样品中过氧化氢酶水平，IPWin6.0 软件分析Western Blot 结果。
1.2.7 统计方法：本实验中所有数据采用SPSS16.0 统计软件分析，采用单因素方差分析和LSD 检验分析IRB 与ASP 对MCAO 模型大鼠的影响，应用简单方差分析检验IRB 与ASP 有无交互效应。数据以
（ ±s）形式表示，P＜0.05 具有统计学意义。
2 结 果
2.1 IRB，ASP，IRB+ASP 对MCAO模型大鼠自发活动率的影响
每只大鼠置于暗室之中通过软件记录10 min 中内的自发活动次数。正常大鼠10 min 的自发活动率为（289.88±22.93）次，第1 组大鼠10 min 的自发活动率（22.63±2.83）次严重降低（P＜0.05），而第4组大鼠 10 min 的自发活动率则保持在较高水平（199.75±6.84）次，第 2 组与第 3 组介于二者之间。见表1。
2.2 IRB，ASP，IRB+ASP 对MCAO 模型大鼠抓力的影响
正常大鼠的抓力约为（0.64±0.12）kg/U，施行 MCAO 手术后，所有大鼠抓力均有不同程度下降，第4 组大鼠降至（0.39±0.01）kg/U，第2 组与第3 组大鼠则分别（0.23±0.05）、（0.20 ±0.02）kg/U，第 1 组下降*为明显，仅剩（0.07 ±0.01）kg/U。见表1。
2.2 IRB，ASP，IRB 联合ASP 对MCAO 模型大鼠梗塞容积的影响
第 1 组大鼠的大脑梗塞容积高达（296.87 ± 24.10）mm3，第 2 组（159.72 ± 15.98）mm3 与第 3 组（164.09±17.64）mm3 则低于第1 组，而第4 组大鼠的梗塞容积*少仅（71.91±13.42）mm3。见表1。
正常大鼠的抓力约为（0.64±0.12）kg/U，施行 MCAO 手术后，所有大鼠抓力均有不同程度下降，第4 组大鼠降至（0.39±0.01）kg/U，第2 组与第3 组大鼠则分别（0.23±0.05）、（0.20 ±0.02）kg/U，第 1 组下降*为明显，仅剩（0.07 ±0.01）kg/U。见表1。
2.3 IRB，ASP，IRB 联合ASP 对MCAO 模型大鼠
第 1 组大鼠的大脑梗塞容积高达（296.87 ± 24.10）mm3，第 2 组（159.72 ± 15.98）mm3 与第 3 组（164.09±17.64）mm3 则低于第1 组，而第4 组大鼠的梗塞容积*少仅（71.91±13.42）mm3。见表1。
2.4 IRB，ASP，IRB + ASP 对 MCAO 模型大鼠TBARS的影响
从检测的结果来看，正常大鼠 TBARS 只有（217.19 ± 15.62） nM/g，接 受 MCAO 手术的大鼠TBARS 水平显著升高，第 1~4 组统计结果依次为（571.15 ± 27.56），（315.42 ± 29.45），（332.13 ±31.94），（257.68±26.80）nM/g。见表1。
2.5 IRB，ASP，IRB+ASP 对MCAO 模型大鼠过氧化氢酶的影响
正常大鼠的过氧化氢酶水平为（76.12±11.74） mU/mg。 与之比较 ，第 1 组大鼠的过氧化氢酶（29.37±4.07）mU/mg，活性明显降低（P＜0.05），第4组大鼠过氧化氢酶（63.56±5.82）mU/mg，活性略有下降 ，而 第 2 组（41.56 ± 5.51） mU/mg 与第 3 组（40.09±5.95） mU/mg 过氧化氢酶活性略高于第 1 组。见表1。
2.6 1.1 IRB与ASP 的交互作用
简单方差分析进一步证实，使用IRB、ASP 的确可以对大脑起到保护作用（P＜0.05）。但是IRB 与ASP 之间是否存在交互作用则有待商榷（自发活动率、抓力、梗塞容积，P＞0.05；TBARS、过氧化氢酶， P＜0.05）。见表2。
3 讨 论
随着**谱的改变，脑卒中已成为成年人功能丧失的主要**之一［5］。由于发病机制尚不明确， 所以脑卒中后的**效果并不甚理想［6］。同时由于该**的**周期长、致病率高、易复发，给患者及其家庭造成了沉重的经济和心理负担，脑卒中的预防显得尤为必要。
在本实验中，我们采用经典的MCAO 模型来模拟脑卒中的发生，并采集了五项指标的数据来反应脑卒中后大脑的损伤情况。其中自发活动率、抓力测试反应行为的改变，梗塞容积直观的反应损伤范围，而TBARS、过氧化氢酶则客观的反应受损脑组织中氧化应激反应的程度。
脑卒中对大脑的影响是明显的。被试大鼠的自发活动由每10 min（289.88±22.93）锐减到（22.63± 2.83）次，而抓力也由（0.64±0.12）kg/U 直降到（0.07±0.01）kg/U。IRB 与ASP可以部分降低大脑血流中断后运动脑组织的损伤，改善这种行为的偏失。通过TTC 染色我们可以直观的看到行单纯MCAO 手术的大鼠大脑右半球大范围白化，而提前给予 IRB、ASP 的大鼠损伤范围则较小，IRB+ASP 组的大鼠损伤面积是所有实验组中*少的，仅为（71.91 ± 13.42）mm3。TBARS 是反应脂质过氧化的一个重要指标。脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起着重要的作用，正常情况下与氧自由基反应处于协调与动态平衡状态，一旦这种协调与动态平衡产生紊乱与失调，就会形成氧自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化。过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。实验结果证实TBARS、过氧化氢酶的水平与大脑损伤程度相关，损伤越大，TBARS 水平越高而过氧化氢酶水平越低。至于IRB 与ASP 是否存在交互作用，目前难以定论，但是有一个现象值得注意，虽然自发活动率、抓力、梗塞容积三项较为宏观的指标均不支持IRB 与ASP 存在交互作用，但是更为微观的生化指标则提示IRB 与ASP 可以增强彼此的效应（表2）；即便是自发活动率、抓力、梗塞容积三项指标，其统计图中的蓝线与绿线也未完全平行，尤其在是代表抓力与梗塞容积的统计图中，两线相交的趋势更为明显。
综上所述，预防性给予IRB 与ASP，即便是短期用药，也能对大脑起到保护性作用。降低脑组织的损伤，IRB 联合ASP 的作用尤为显著。多篇文献报道服用ASP 可有效预防脑卒中的发生［7，8］，长期服用 IRB 与ASP 是否可以并在多大程度上降低脑卒中的发生值得进一步探讨。在分析数据的过程中我们发现单独给予IRB、ASP 的效果无明显差异，尽管两种**的结构及药理作用大相径庭，但IRB 与ASP 在预防脑卒中发生及降低脑损伤的作用是否别无二致则需要进一步研究来证实。总之，尽管在脑卒中病因发病机理、预防、**等领域还有许多谜团亟待解决，本研究也不失为一次有益的尝试。