可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒本试剂盒仅供研究使用
可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒的实验原理
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗SFAS-L 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗SFAS-L 抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的SFAS-L 呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate ): 一块(96孔)。
2. 标准品(Standard): 2瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent): 1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent): 1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(HRP-avidin Diluent) 1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody): 1×120μl/瓶(1:100)。
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin): 1×120μl/瓶(1:100)。
8. 底物溶液(TMB Substrate): 1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液(Wash Buffer) 1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液(Stop Solution): 1×10ml/瓶。
可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,*好用多通道移液器
6. 蒸馏水,容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可立即检测;或进行分装,并将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心,然后检测。
2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 g离心15分钟,取上清即可立即检测;或进行分装,并将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心,然后检测。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000g离心20分钟,取上清即可立即检测;或进行分装,并将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心,然后检测。
注:标本溶血会影响*后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则:
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。*后计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则:2瓶,使用前于6000-10000rpm离心30秒。每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10 ng/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25ng/ml, 0.62 ng/ml, 0.32ng/ml, 0.16 ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml,临用前15分钟内配制,用完丢弃,下次检测使用新鲜配置的标准品。
如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)10 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则:
打开瓶盖前请离心,收集瓶壁上的溶液。临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:
打开瓶盖前请离心,收集瓶壁上的溶液。临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒操作步骤
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。加样时,枪头应直接对准液面,切勿沿孔壁加样。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。
5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔显色不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
实验备注
1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是*后加底物溶液及终止液。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
可溶性调亡因子 sFAS-L 酶联免 elisa疫试剂盒计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间*好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线,*好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请*后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
9. 试剂盒保存:未开封的试剂盒应储存于2-8℃;开封后的酶标板应与干燥剂一起储存于铝箔袋中置于2-8℃保存。仅在此出储存条件下,产品在有效期内可正常使用。
10. 浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
11. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
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