高效液相色谱法（HPLC）因其定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广、分析检出限低等优点，近年来得到了迅速发展，几乎可以应用于所有大分子有机物的分析。
可以预见，高效液相色谱仪器的应用将在农业、轻、重、海、陆、空、食、衣、用等各个领域无处不在，无处不在。但是，如何用好高效液相色谱柱是一个非常关键的问题。
1、高效液相色谱柱及柱外相关问题
1）色谱峰拖尾：与色谱柱、流动相流速、样品等有关，必须从这些方面找出拖尾的原因。
2）如何延长色谱柱的寿命：维护很重要。长期不使用时，用甲醇浸泡。严格控制洗柱时间或洗柱溶剂的体积。一般应使用甲醇（或水：甲醇为20：80）洗涤45分钟或床体积的20倍。
3）必须注意控制“柱外效应”。所谓“柱外效应”，是指在 HPLC 系统中，由于管子、连接件、进样器、流通池以及柱系统的死体积所引起的色谱峰展宽效应。
4）进样：自动进样时，应经常对自动进样器进行检测，要求仪器进样器稳定可靠；手工采样时，要特别注意采样的细节和感觉。
2、高效液相色谱柱质量
1）色谱柱的柱效：塔板数越高越好，要特别注意影响柱效的因素。塔板数下降到一定程度时报废。
2）重复性：当色谱柱重复使用时，zui大RSD可保持在0.1%以下。
3）耐久性（寿命）：因为柱效容易降低，所以要注意柱子保护。
4）色谱柱使用后必须清洗干净，以免腐蚀、堵塞、减少塔板数。一般应以床体积的20倍冲洗。 对于每隔几天使用的HPLC，应先用20%甲醇：80%水洗30分钟左右，然后再用纯甲醇洗20分钟后保存。
3、流动相问题
1）pH值特别重要：一般C18柱的pH值小于3时，很容易损坏色谱柱，但小的pH值可用于耐酸柱。
2）请注意试剂截止波长的选择：如乙腈截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等。
3）流速：流速要合适，否则会影响峰形，浪费溶剂。一般常规分析通常选择1ml/min。
4、溶剂预处理 zui好使用HPLC级的溶剂，使用前必须过滤脱气。请注意以下事项：
1）过滤目的： 溶剂进泵前和进样前应过滤除去溶剂中的微小颗粒和微生物，以保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，分析数据要可靠。
2）对过滤器的要求及zui大孔径的选择方法： 对过滤器的一般要求：速度快、溶解速度小、死体积小、孔径精 确、体积合适、化学相容性好等。
对于孔径选择方法：如果柱填料直径小于3μm或无菌过滤，一般选择0.2μm孔径；如果柱填料直径大于5μm，选择0.45μm；如果是预过滤或过滤困难的样品，一般选择1μm孔径。 尤其是用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器。否则，不可能得到可靠的分析和测试数据。
3）脱气：
主要目的是去除溶解在流动相中或混合产生的气泡。液相色谱中zui常用的流动相脱气是离线超声振动脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。进入液相泵的流动相中的气泡会引起压力波动，这是非常有害的，必须消除。可以打开排水阀以高流速冲洗。
5、缓冲溶液
1） 缓冲液在使用前必须过滤。
2）溶剂和样品容易滋生**和霉菌，因此请对其进行清洁。
3）一般有机溶剂不能直接用于清洗和洗涤。
4）梯度洗脱时，选择吸光值低的缓冲液，例如：梯度洗脱时，缓冲液与相应的有机物预混以防止盐析。在峰不拖尾的情况下，尽量使用低浓度的缓冲盐，防止盐析；缓冲盐浓度一般在20～30mm左右。
如果流动相中有机相含量较高，则流动相中缓冲盐的浓度不能太高，盐浓度至少要保证在流动相条件下不会沉淀。离子对缓冲液的浓度要高一些，一般为50-100mm。
6、喷油器的清洁 对于注射器或注射针，请注意三点：
1）对进样器的要求：自动进样，进样速度快，有的仪器进样只需17秒。
2）采样室要求可控：一般采用Peltier冷却，温度控制范围为4℃-100℃。
3）要特别注意注射残留物的清洁（主要是清洁针头）。
