随着对中间体和zui终化合物的反相快速色谱的需求增加，合成化学家提出了一个有趣的问题。从历史上看，正相快速色谱一直是合成中间体的“首 选”纯化工具。然而，今天，中间体和zui终产品越来越两极分化。这些极性反应混合物在使用正相（二氧化硅）进行分离和回收时都面临纯化挑战，因此需要使用反相快速色谱法。

对于不熟悉该技术的人来说，反相色谱使用填充有疏水固定相的色谱柱。反相使用的溶剂通常与水混溶，常用的是甲醇和乙腈。其他不太受欢迎的反相溶剂包括四氢呋喃和丙酮。

虽然正相允许使用具有不同选择性选项的多种溶剂，但反相是有限的。话虽如此，当改变有机溶剂时，有时会在反相中看到选择性差异，这可以改善某些化合物的分离——这是本文的主要关注点。

决定使用甲醇或乙腈的其他变量包括……

- 成本

- 粘度

- 紫外线吸收

成本

如果您曾经购买过溶剂，您可能已经注意到，甲醇比乙腈便宜得多，便宜 4 倍，这当然是证明���用于日常反相快速色谱的一个令人信服的理由。

虽然节省溶剂费用是有道理的，但还应考虑上述其他参数。

粘度

水是极性的并且相当粘稠，至少与大多数溶剂相比是这样。当与其他溶剂混合时，粘度会随着有机物的增加（高达约 50%）而增加，这反过来又会提高背压，图 1。

随着有机溶剂百分比增加超过50%，粘度和压力会降低。这很重要，因为在快速纯化过程中增加压力会限制流速、增加纯化时间，有时还会导致系统超压。如果这是一个问题，乙腈会是更好的选择。

图 1. 压力与水中有机溶剂的百分比。当每种溶剂的有机百分比接近50%时，压力达到zui大值。

紫外线吸收

大多数溶剂在一定程度上吸收紫外线。然而，水和乙腈在198nm以上是完全紫外线透明的，这是大多数商业光系统紫外线检测器的下限。甲醇、四氢呋喃和丙酮都会吸收且阻碍化合物检测的紫外光。

选择性

在评估不同的溶剂混合物时，并非所有化合物都会显示出改变的洗脱模式。但是，如果您发现有一对化合物在一种溶剂中的分离效果不佳，何不快速评估另一种溶剂呢？

为了帮助说明评估不同溶剂所带来的好处，我举了一个特别有趣的例子。被纯化的粗物质是一种天然产物提取物，我尝试首先使用反相和60-100%甲醇-水梯度进行纯化，图 2。

该梯度提供了四种zui丰富的化合物的一些分离，但无法完全分离，使用 Biotage Isolera Dalton 2000 快速系统和12克Biotage Sfär C18色谱柱将一种 +m/z 为 302.8 的化合物与另一种 +m/z 为 272.8 的化合物进行分析。

图 2. 使用水-甲醇梯度的反相纯化。在线质量检测器证实了 +m/z 272.8 和 +m/z 302.8（粉红色峰）的化合物未完全分离。

为了改进色谱，我将甲醇换成乙腈，并运行 40-100% 的乙腈-水梯度。令我高兴的是，乙腈提供了不同的选择性，在 +m/z 272.8 的化合物之前洗脱了 +m/z 302.8 的化合物，并产生了更好的整体分离，图 3。

图 3. 使用水-乙腈梯度对天然产物提取物进行反相纯化改变了洗脱顺序并改进了纯化。现在，具有 +m/z 302.8（蓝色峰）的化合物比具有 +m/z 272.8（黄色峰）的化合物更早流出。

该数据是否表明乙腈应该是反相中的首 选溶剂？不，尽管它确实支持在创建反相快速纯化方法时应评估甲醇和乙腈的建议。