共聚焦显微镜与普通光学显 微镜的比较

共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较

        显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外显微镜中的紫外光）为光源，后者以电子束为光源。普通光学显微镜和激光共聚焦显微镜同属于光学显微镜的范畴。
         1.普通光学显微镜
        普通生物显微镜由三部分组成，即：①照明系统，包括光源和聚光镜； ②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差除色差外，目镜和物镜都由一个复杂的透镜组组成； ③采用机械装置固定材料，便于观察。
        显微镜图像是否清晰不仅取决于放大倍数，还与显微镜的分辨率有关。分辨率是指显微镜（或人眼距离目标25cm）分辨物体间*小距离的能力。大小由光的波长、孔径比和介质的折射率决定，用公式表示：
         R=0.61λ /NANA =nsinα/2
        其中：n=中等折射率； α=透镜角（样品对物镜的张角），NA=数值孔径。镜头角度总是小于180°，所以sina/2的*大值必须小于1。
        用于制作光学透镜的玻璃的折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃越好。对于干物镜，介质为空气，透镜孔径比一般为0.05～0.95；油性镜片以雪松油为介质，镜片孔径比可接近1.5。
        普通光的波长为400~700nm，所以显微镜的分辨率值不会低于0.2μm，而人眼的分辨率是0.2mm，所以一般显微镜设计的*大放大倍数通常为1000X。
         2. 激光共焦扫描显微镜
        激光共聚焦扫描显微镜，以激光为扫描光源，逐点、逐线、并排快速扫描成像，扫描激光和荧光采集共用一个物镜，扫描激光的焦点是物镜也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长很短，光束很细，所以共聚焦激光扫描显微镜的分辨率更高，与普通光学显微镜的分辨率差不多。3次。系统聚焦一次，扫描仅 限于样品的一个平面。当聚焦深度不同时，可以获得样品不同深度级别的图像。图像信息存储在计算机中，通过计算机分析和模拟，可以显示细胞样本的三维结构。
        为什么我们需要共聚焦显微镜？
         1、光学显微镜经过我们伟大的前辈的努力和改进，已经完善。事实上，通常的显微镜可以简单快捷地为我们提供美丽的显微图像。然而，为这个近乎上乘的显微镜世界带来革  命性创  新的事件发生了，这就是“激光扫描共聚焦显微镜”的发明。这种新型显微镜的特点是采用光学系统，只提取焦点聚焦表面的图像信息，并在改变焦点的同时将获得的信息恢复到图像存储器中，从而获得完整的3维图像。信息。智慧的明亮形象。通过这种方法，可以容易地获得关于用普通显微镜无法确认的表面形状的信息。另外，对于普通光学显微镜来说，“提高分辨率”和“加深焦深”是相互矛盾的条件，尤其是在高倍率下，这一矛盾更加突出，但对于共焦显微镜来说，这个问题就迎刃而解了。
         2、共焦光学系统的优势
        激光共聚焦显微镜原理图
        共焦光学系统是照射样品，反射光也利用点接收器接收光。当样品放在焦点上时，几乎所有的反射光都能到达感光器。当样品失焦时，反射光无法到达感光器。也就是说，在共焦光学系统中，只会输出与焦点重合的图像，屏蔽掉光斑和无用的散射光。
         3. 为什么要使用激光？
        在共焦光学系统中，对样品进行点照明，反射光也被点光感受器接收。因此，点光源成为必要。激光是非常点光源。在大多数情况下，共聚焦显微镜的光源是激光光源。此外，激光器的单色性、方向性和优异的光束形状也是其被广泛采用的重要原因。
         4. 可基于高速扫描进行实时观察
        激光扫描，水平方向采用声光偏转单元（Acoustic Optical Deflector，AO元件），垂直方向采用声光偏转单元（Acoustic Optical Deflector，AO元件）伺服电流镜（Servo Galvano-mirror）用于直线方向。由于声光偏转单元没有机械振动部分，因此可以进行高速扫描，可以在监控屏幕上进行实时观察。这种成像的高速度是一个非常重要的项目，它直接影响着对焦和位置检索的速度。
         5.焦点位置与亮度的关系
        在共焦光学系统中，当样品正确放置在焦点位置时，亮度*大，前后亮度会急剧下降（图4实线）。焦平面的这种灵敏选择性也是共焦显微镜高度方向测量和焦深扩展的原理。相比之下，普通光学显微镜在焦点位置前后不会有明显的亮度变化（图 4 中的虚线）。
         6. 高对比度和高分辨率
        在普通光学显微镜中，焦点部分的反射光会发生干涉，并与焦点成像部分重叠，导致图像对比度降低。另一方面，在共焦光学系统中，焦点外的散射光和物镜内的散射光几乎被完全去除，因此可以获得对比度非常高的图像。另外，由于光线两次通过物镜，点像先锐化，也提高了显微镜的分辨率。
         7. 光学定位功能
        在共焦光学系统中，与焦点重合的点外的反射光被微孔屏蔽。因此，在观察三维样品时，形成的图像就好像样品被切片一样，焦点朝向样品（图5）。这种效应称为光学定位，是共焦光学系统的特性之一。
         8.焦点移动记忆功能
        焦点外的所谓反射光被微孔屏蔽。如果从另一侧看，可以认为共焦光学系统形成的图像上的所有点都与焦点重合。因此，如果将三维样本沿Z轴（光轴）方向移动，图像就会累积并存储在存储器中，*终会得到整个样本与焦点重叠形成的图像。这样无限加深焦深的功能就叫做移动记忆功能。
         9.表面形状测量功能
        在焦点移动功能上，增加一个循环记录表面的高度，可以非接触方式测量样品的表面形状。基于这个函数，可以记录每个像素的*大亮度值形成的Z轴坐标，根据这个信息可以得到样本与表面形状相关的信息。
         10.高精度微尺寸测量功能
        受光单元采用一维CCD成像传感器，不受扫描装置扫描倾斜的影响，可完成高精度测量。此外，由于同时使用了焦深可调（加深）的焦点移动记忆功能，可以消除焦点偏移引起的测量误差。
         11、三维图像分析
        使用表面形状测量功能，您可以轻松制作样品表面的三维图像。不仅如此，还有多种分析如：表面粗糙度测量、面积、体积、表面积、圆度、半径、*大长度、周长、重心、断层图像、FFT变换、线宽测量等。
        共聚焦激光扫描显微镜可用于观察细胞形态，以及细胞内生化成分的定量分析、光密度统计和细胞形态测量。