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液相色谱仪原理是什么？

高效液相色谱是在经典色谱的基础上，引用了气相色谱的理论。技术上，流动相改为高压输送（*高输送压力可达4.9107Pa）；色谱柱采用特殊方法填充小粒径填料，使柱效远高于经典液相色谱（每米塔板数可达数万或数十万）；同时，在立柱后面有一个高灵敏度的检测器，可以检测流过的物体被连续检测。
        特征
        1、高压：液相色谱以液体为流动相（称为载液）。液体流过色谱柱并受到更大的阻力。为了快速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
         2、速度快：流动相在柱内的流速比经典色谱法快很多，一般可达1-10ml/min。高效液相色谱所需的分析时间远小于经典液相色谱，一般小于1h。
         3. 高效：*近开发了许多新的固定相，大大提高了分离效率。
         4、灵敏度高：高效液相色谱广泛采用高灵敏度检测器，进一步提高分析灵敏度。例如荧光检测器的灵敏度可达10-11g。此外，样品体积较小，通常为几微升。
         5、应用范围广：气相色谱与高效液相色谱对比：气相色谱虽然具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等优点，但受技术条件限制，沸点太高高的。高物质或热稳定性差的物质很难用气相色谱法分析。高效液相色谱法只要求样品无需汽化即可制成溶液，因此不受样品挥发性的限制。对于沸点高、热稳定性差、相对分子量大（400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总量的75%～80%），原则上可采用高效液相色谱法用于分离和分析。据统计，在已知的化合物中，约20%可以用气相色谱分析，约70-80%可以用液相色谱分析。
        高效液相色谱可分为高效凝胶色谱、疏水高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱和高效聚焦液相色谱等类型。不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理与相应普通液相色谱的原理基本相同相似。不同的是，高效液相色谱灵敏度高、速度快、分辨率高、重复性好，必须在色谱仪上进行。
        高效液相色谱的主要类型及其分离原理
        根据分离机理的不同，高效液相色谱可分为以下主要类型：
         1. 液液分配色谱和化学键合相色谱
        流动相和固定相都是液体。流动相与固定相应不混溶（极性不同，避免固定液流失），并应有明显的界面。当样品进入色谱柱时，溶质分布在两相之间。当达到平衡时，遵循以下公式：
        式中，cs——固定相中溶质的浓度； cm——流动相中溶质的浓度； Vs——固定相的体积； Vm——流动相的体积。 LLPC和GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K越大的组分保留值越高；但也存在差异。 GPC中，flow对K影响不大，LLPC flow对K影响较大。
        一种。正相液相色谱：流动相的极性小于固定液的极性。
        湾反相液相色谱：流动相的极性大于固定液的极性。
         C。液液分配色谱的缺点：虽然流动相和固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有少量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力会影响固定液的流失。 1970 年代后期发展起来的化学键合固定相（见下文）可以克服上述缺点。现在被广泛使用（70~80%）。
         2. 液固色谱法
        流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据吸附物质的不同来进行分离的。作用机理是：当样品进入色谱柱时，溶质分子（X）和溶剂分子（S）竞争吸附在吸附剂的表面活性中心上（不进样时，吸附剂的所有活性中心吸附S)，可以表示为：
         Xm+nSa======Xa+nSm
        其中： Xm——流动相中的溶质分子； Sa——固定相中的溶剂分子； Xa——固定相中的溶质分子； Sm——流动相中的溶剂分子。
        当吸附竞争反应达到平衡时：
         K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
        其中： K 是吸附平衡常数。【讨论：K越大，保留值越大。 ]
         3. 离子交换色谱（Ion-exchange Chromatography）
         IEC 使用离子交换剂作为固定相。 IEC 基于离子交换树脂上的可电离离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子的可逆交换。这些离子根据它们与交换剂的不同亲和力进行分离。
        以阴离子交换剂为例，交换过程可表示为：
         X-(在溶剂中)+(树脂-R4N+Cl-)===(树脂-R4N+X-)+Cl-(在溶剂中)
        当交换达到平衡时：
         KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
        分配系数为：
         DX=[-R4N+ X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
         【讨论：DX与留存的关系】
        凡能在溶剂中电离的物质，通常都可以用离子色谱法进行交换分离。
         4. 离子对色谱（Ion Pair Chromatography）
        离子对色谱是将与溶质分子电荷相反的一个（或多个）离子（称为反离子或反离子）加入流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用以下公式表示：
         X+水相+Y-水相===X+Y-有机相
        其中： X+水相--要在流动相中分离的有机离子（也就是阳离子）； Y-水相-流动相中带相反电荷的离子对（如四丁基氢氧化铵、十六烷基三甲基氢氧化铵等）； X+Y---形成的离子对化合物。
        当达到平衡时：
         KXY=[X+Y-]有机相/[X+]水相[Y-]水相
        根据定义，分配系数为：
         DX=[X+Y-]有机相/[X+]水相=KXY[Y-]水相
        【讨论：DX与留存的关系】
        离子对色谱（特别是反相）解决了以往难以分离的混合物，如酸、碱及离子和非离子混合物的分离问题，特别是一些生化样品，如核酸、核苷、生物碱和药物是分开的。
         5. 离子色谱
        使用离子交换树脂作为固定相，电解质溶液作为流动相。电导检测器用作通用检测器。为了消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。分离柱和抑制柱上样品组分的反应原理与离子交换色谱法相同。
        以阴离子交换树脂（R-OH）为固定相分离阴离子（如Br-）为例。当被测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应是交换反应的逆过程）：
        抑制柱上发生的反应：
         R-H++Na +OH-===R-Na++H2O
         R-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-
        可以看出，洗脱液通过抑制柱转化为电导率。水的小值消除了背景电导率的影响；样品阴离子Br-转化为相应的酸H+Br-，可通过电导法灵敏检测。
        离子色谱法是分析溶液中阴离子的*佳方法。也可用于阳离子分析。
         6. 空间排阻色谱
        空间排阻色谱使用凝胶作为固定相。它的作用与分子筛相似，但凝胶的孔径比分子筛大很多，一般从几纳米到几百纳米不等。溶质不是通过两相之间不同的相互作用力分离的，而是通过分子大小分离的。分离仅与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。样品进入色谱柱后，随流动相在凝胶外和孔旁的间隙中流动。在样品中，一些过大的分子无法进入凝胶孔而被排除，因此它们直接通过色谱柱，首先出现在色谱图上。一些非常小的分子可以进入所有凝胶孔并渗透到颗粒中。这些组分色谱柱上的保留值*大，并且出现在色谱图的*后。
        高效液相色谱仪主要有进样系统，输液系统，。分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别介绍它们的组成和特点。
         1. 采样系统
        一般采用隔膜进样器或高压进样室完成进样操作，进样量恒定。这有利于提高分析样品的重复性。
         2. 输液系统
        该系统包括三部分：高压泵、流动相容器和梯度计。高压泵的一般压力为l。 47～4.4X107Pa，流量可调稳定。当高压流动相通过色谱柱时，可以降低样品在柱内的扩散效应，加快其在柱内的移动速度，有利于提高分离度和样品的回收率。、保持样品的生物活性等都是有益的。流动相储存误差和梯度计可以根据固定相和样品的性质改变流动相，包括改变洗脱液的极性、离子强度和pH值，或使用竞争性抑制剂或变性剂。这使得多种物质（即使只有一组差异或异构体）可以有效分离。
         3.分离系统
        该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱的长度一般为10-50cm（需要两根时，可在两者之间加一根连接管），内径为2-5mm，它由上等不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金制成。有粒径为5-10μm的固定相（由基质和固定液组成）。固定相中的基质由机械强度高的树脂或硅胶制成，它们都是惰性的（如硅胶表面的碱性硅胶基因）。已去除）、孔隙率（孔径可达1000?）和大比表面积，再加上其表面被机械包覆（与气相色谱中固定相的制备相同），或化学偶联各种基因（如磷酸盐）、季胺、羟甲基、苯基、氨基或各种长度的碳链烷基等）或配体有机化合物。因此，这种固定相对于不同结构的物质具有很好的选择性。例如，在多孔硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，可以分离成纤维细胞中的糖蛋白。
        另外，固定相基质粒小，柱床容易达到均匀致密的状态，容易降低涡流扩散的影响。基体粒径小，微孔浅，样品在微孔区传质短。这些有利于减小带宽和提高分辨率。根据柱效理论分析，基质粒径越小，理论塔板数N越大。这也进一步一步一步证明，矩阵的小尺寸会提高分辨率。
        此外，高效液相色谱的恒温器可以将温度从室温调节到60℃。通过提高传质速率和缩短分析时间，可以提高色谱柱的效率。
         4.检测系统
        高效液相色谱中常用的检测器有三种：紫外检测器、折光率检测器和荧光检测器。
         (1) 紫外线检测器
        该检测器适用于检测吸收紫外光（或可见光）的样品。其特点：用途广泛（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、肽、激素等）；灵敏度高（检出限为10-10g/ml）；线性范围宽；温度和流速无变化灵敏；可以检测用梯度溶液洗脱的样品。
         (2) 示差折光检测器
        折射率与流动相不同的��有样品组分都可以通过示差折光检测器进行检测。目前，大部分碳水化合物化合物的检测都采用这种检测系统。该系统通用性强，操作简单，但灵敏度低（检出限为10-7g/ml）。流动相的变化会引起折射率的变化。因此，既不适合痕量分析，也不适合痕量分析。梯度洗脱样品检测。
         (3) 荧光检测器
        对于具有荧光的物质，在一定条件下，发出的光的荧光强度与该物质的浓度成正比。因此，该检测器仅适用于荧光有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度非常高（检出限为10-12～ 10-14g/Ml)，既可以进行痕量分析，也可以进行梯度洗脱检测工作。
         (5) 数据处理系统
        该系统可以采集、存储、显示、打印和处理测试数据，从而正确地进行样品的分离、制备或识别。

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