水质沙门氏菌检验--ATP荧光检测仪技术文章
1 范围
本标准规定了水中沙门氏菌的检验方法。
本方法适用于未经处理的污水除外的各类水。
2 规范性引用文件
下类文件中的条款通过引用而成为本国际标准的条款。著明出版日期的,其印刷版本适用于本标准。鼓励通过本标准达成协议的各方对以下这些标准的可行性进行研究。IEC 和 ISO 成员对现行国际标准进行可行性研究。
ISO 3696:1987. 实验室分析用水—特殊要求和检验方法
ISO 5667-1:1980. 水质—取样—第1部分:取样方案设计规程
ISO 5667-2:1980. 水质—取样—第2部分:取样技术规程
ISO 5667-3:1980. 水质—取样—第3部分:样品的制备和运送
ISO 6579:1993. 微生物学—沙门氏菌检验一般性规程
3 定义
对于本国际标准提出以下定义。
3.1 沙门氏菌:革兰氏阴性,氧化酶阴性、无芽胞无荚膜**,固体选择性培养基上菌落为2mm~4mm大小,典型菌落进行生化和血清学试验的结果必须符合本标准的描述。
3.2 沙门氏菌属的检验:执行本国际标准的沙门氏菌检验对样品体积有特殊要求。
4 原则
本方法有4个步骤
4.1 前增菌
前增菌是受伤**生长的必要步骤。将已知体积的样品或过滤细胞滤膜加入非选择性增菌液,在指定的温度下进行培养。
4.2 增菌—选择性液体培养基
选择性增菌是自然背景中沙门氏菌特殊增殖的重要步骤。因此,将一定体积前增菌肉汤转种到孔雀石绿氯化镁肉汤(改良RV肉汤),并在指定温度下增殖以提高培养的选择性。
4.3 固体培养基
固体培养基是液体肉汤增菌后进行分离和检验的步骤,为提高沙门氏菌的检出率至少需要以下两种不同的选择培养基。
煌绿酚红乳糖琼脂
木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂
亚硫酸铋琼脂
4.4鉴定
固体培养基上出现典型菌落不能作为检出沙门氏菌的依据,不同培养基上的菌落必须进行生化和血清学鉴定。
5 培养基和鉴定试剂
5.1 培养基
5.1.1 前增菌培养基:缓冲蛋白胨水
5.1.1.1 成分
单料 双料
蛋白胨 10g 20g
NaCl 5g 10g
Na2HPO4.12H2O 9g 18g
KH2PO4 1.5g 3g
蒸馏水 1000ml 1000ml
5.1.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水缓慢加热至完全溶解,不能煮沸。调节pH 值至7.2±0.1,分装至试管或培养瓶,121℃±1℃高压**15min。储存于冰箱中3个月内使用。
5.1.2 增菌培养基:孔雀石绿氯化镁乳糖肉汤
5.1.2.1 培养基基础
成分
胰蛋白胨 4g
大豆胰胨 1g
NaCl 8g
K2HPO4.3H2O 0.4g
KH2PO4 0.6g
蒸馏水 1000ml
添加剂1
MgCl.6H2O 31.7g
蒸馏水 100 ml
添加剂2
孔雀石�� 0.4g
蒸馏水 100 ml
5.1.2.2 制法
将各成分加入蒸馏水缓慢加热至完全溶解,不能煮沸。加入添加剂1和10ml添加剂2,调节pH 值至5.2±0.1,按每管10ml分装,115℃±1℃高压**15min。
5.1.3 目标增菌培养基:亚硒酸胱氨酸肉汤
5.1.3.1 成分
蛋白胨 5g
L-胱氨酸 0.01g
乳糖 4g
Na2HPO4 10g
NaHSeO3 4g
蒸馏水 1000ml
5.1.3.2 制法
将各成分加入蒸馏水缓慢加热至完全溶解,不能煮沸、不需高压**。调节pH 值至7.0±0.2。
5.1.4 选择性固体培养基
5.1.4.1 煌绿酚红乳糖琼脂
5.1.4.1.1成分
培养基基础
肉浸膏 5g
胰蛋白胨 5g
Na2HPO4 1g
NaH2PO4 0.6g
琼脂 15g
蒸馏水 900ml
添加剂1
乳糖 10g
蔗糖 10g
酚红 0.09g
蒸馏水 100ml
添加剂2
煌绿 0.5g
蒸馏水 100ml
5.1.4.1.2 制法
加入蒸馏水溶解培养基基础,121℃±1℃高压**15min。
加入蒸馏水溶解添加剂1,水浴70℃加热20min,待自然冷却至55℃±1℃。
加入蒸馏水溶解添加剂2,避光保存1天以上已待自动**。
临用前熔融培养基基础,加入添加剂1和1ml添加剂2,调节pH 值至7.0±0.1,倾注平皿后立即使用不宜储存。
5.1.4.2 木糖赖氨酸脱氧胆酸纳琼脂
5.1.4.2.1 成分
培养基基础
D-木糖 3.5g
L-赖氨酸 5g
脱氧胆酸钠 2.5g
酵母浸膏 3g
蔗糖 7.5g
乳糖 7.5g
NaCl 5g
Na2S2O3 6.8g
枸橼酸铁 0.8g
琼脂 13g
蒸馏水 1000ml
添加剂
酚红 0.4g
蒸馏水 100ml
5.1.4.2.2 制法
将培养基基础各成分及20ml酚红溶液加入蒸馏水缓慢加热煮沸至完全溶解,调解pH值至7.4±0.1。
5.1.4.3 亚硫酸铋琼脂(BS 琼脂)
5.1.4.3.1 成分
培养基基础
肉浸膏 5g
蛋白胨 10g
D-葡萄糖 5g
NaH2PO4 4g
FeSO4:7H2O 0.3g
Bi2(SO3)3 8g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
添加剂
煌绿 0.5g
蒸馏水 100ml
5.1.4.3.2制法
将培养基基础各成分及5ml煌绿溶液加入蒸馏水缓慢加热煮沸至完全溶解,不需高压**。调解pH值至7.6±0.1,按每平皿20ml倾注琼脂。
5.2 鉴定培养基
5.2.1 营养琼脂
5.2.1.1 成分
肉浸膏 3g
蛋白胨 5g
NaCl 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
5.2.1.2制法
将各成分加入蒸馏水缓慢加热煮沸至完全溶解,调解pH值至7.0±0.1,121℃±1℃高压**15min。按每平皿20ml倾注琼脂。
5.2.2 双糖铁琼脂
培养基基础
肉浸膏 3g
酵母浸膏 3g
蛋白胨 20g
乳糖 10g
D-葡萄糖 1g
NaCl 5g
Na2S2O3 0.3g
枸橼酸铁 0.5g
琼脂 12g
蒸馏水 1000ml
添加剂
酚红 0.4g
蒸馏水 100ml
5.2.2.2 制法
将培养基基础各成分及6ml酚红溶液加入蒸馏水缓慢加热至完全溶解。调解pH值至7.4±0.1,121℃±1℃高压**15min。按每管6ml分装**试管,倾斜摆放并保证每管底层高度为2.5cm。
5.2.3尿素酶琼脂
培养基基础
蛋白胨 1g
D-葡萄糖 1g
NaCl 5g
KH2PO4 0.3g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
添加剂1
酚红 0.4g
蒸馏水 100ml
添加剂2
尿素 40g
蒸馏水 100ml
5.2.3.2 制法
将培养基基础各成分及3ml酚红溶液加入蒸馏水缓慢加热至完全溶解。121℃±1℃高压**15min。待温度降至50℃,在950ml培养基中加入50ml尿素溶液,按每管6ml分装**试管,确保*终pH值至6.8±0.1。
5.2.4 L-赖氨酸脱羧酶肉汤
培养基基础
L-脱氧赖氨酸 5g
酵母浸膏 3g
蛋白胨 5g
D-葡萄糖 1g
蒸馏水 1000ml
添加剂
溴甲酚紫 0.5g
蒸馏水 100ml
5.2.4.2制法
将培养基基础各成分及3ml溴甲酚紫溶液加入蒸馏水缓慢加热煮沸至完全溶解。调解pH值至6.8±0.1,按每管6ml分装**试管,121℃±1℃高压**15min。
5.3 血清
有资格的实验室提供。
6 设备
6.1 烤箱 玻璃仪器**,温度可达到并维持170℃至175℃ 1h。
6.2 高压蒸汽**锅 培养基和试剂**,温度可达到并维持121℃±1℃和115℃±1℃。
6.3 水浴箱 温度可达到并维持70℃±1℃。
6.4 培养箱 温度可达到并维持36℃±2℃。
6.5 水浴箱或培养箱 温度可达到并维持42℃±0.5℃。
6.6 pH 计 25℃**到0.1 pH单位。
6.7 接种环 直径3mm。
6.8 培养皿 可**,直径90mm或100mm。
6.9 滤膜过滤器 可**,直径47mm或50mm滤膜孔经0.45μm。
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