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分享一个连接与转化的试验经历 -多功能混匀仪技术文章
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连接与转化首先要做好试验准备**步、回收你的DNA片断如果你的条带在跑电泳检测的时候不是很亮,那建议你直接用QIAGEN的PCR产物回收试剂盒,产率相当高,效果很好。那万一你的条带很亮,而且没有杂带,那建议你不要犹豫,直接切胶回收,当然回收用的试剂盒要求就不是很高了,随便一种试剂盒都估计没问题。那万一你的条带很亮,但是有杂带,那建议你也用切较回收的方法,不过呢,如果你的目的片断在1Kb以下,建议你配一块2%的胶,电压70-80伏左右,跑四十分钟左右,切较回收。如果你的条带在1kb以上,那建议你配一块0.5%胶,电压90伏左右,跑三十分钟左右,切不可电压调得太大,这样时间一长,很容易造成发热,导致你的目的片断的部分降解,即使没有降解也会使你的条带跑的乱七八糟。切记。**步、作连接用TaKaRa的pMD18-T载体试剂盒,如果你的目的片断浓度较高,那建议你调节成vector:insert DNA=1:3的比例,使链接效果达到*佳。连接只需在16摄氏度条件下进行30分钟,即可完成连接反应,当然如果你的目的片断浓度相对较低,那建议你 适当延长连接时间,比如可以连接过夜,这样也可以达到较好的连接效果。第三步、做转化这一步是*关键的具体分成以下几步: 1、从-80℃下取出自己的感受态细胞(当然,如果要自己现制做感受态细胞的话,那建议你在配置的过程中,所有的器皿都要洗干净,但千万不要用洗涤剂,即使用了也要一定保证冲洗干净)在冰上溶解。 2、将你的连接产物如果是10μι,(当然他们的试剂盒500块,但是只能做20次,所以建议你减半,就是每次只用0.5μι,同样可以达到较好的效果的)加入到你的已经溶解的感受态细胞中,用枪头轻轻混匀(记住,一定要混匀),冰上放置30Min 3、42℃热击90s(*好是这个时间),然后快速将你的离心管放到冰浴中,3-10min。 4、每管加入300μι(如果你用的是1.5ml的离心管建议你家的LB培养基千万不要超过离心管的三分之一,因为加多之后会严重抑制菌的生长)无抗性的LB液体培养基,37℃,200rpm/min,培养45min,(如果是100rpm/min,培养时间可以为一个小时)。 5、取50μι涂板(如果有人不放心,*多100涂板,千万不可过多)。 6、挑单克隆。
转自生命科学论坛
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