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酵母双杂交操作注意事项(个人经验总结)-多功能混匀仪技术文章
酵母双杂交操作注意事项(个人经验总结)-多功能混匀仪技术文章
酵母双杂交操作注意事项(个人经验总结)-多功能混匀仪技术文章
1.
要使用独立的称量药勺称取不同培养基组分,防止交叉污染,以免营养筛选效果不佳。
2.
将酵母划线于培养平板时,动作应轻柔。如若固体培养基表面划破,该处酵母将无法生长。划线可以使用微量移液器
tip
头,也可以使用接种环。初起操作动作不熟练时,可以将
tip
头在酒精灯上加热,使**圆滑后使用,一般可以避免划伤固体培养基。
3.
接种至液体培养基应接种足量菌体,使
OD600
达到
0.2
。过低浓度的菌体无法生长。克隆较小时,可以挑取多个克隆接种到同一培养管中,或者以较少的液体培养基先行培养一段时间以富集酵母,后逐渐增加培养基体积。
4.
酵母培养不能使用尖底容器。酵母比重较大,在震荡培养过程中,易于沉积于培养容器底部,因而尖底管不适合用于酵母培养。如
1.5mlEP
管,
15ml
离心管等。尽量使用
2ml
圆底
EP
管,
50ml
离心管等。
5.
培养酵母过程中,充分分散菌体十分重要。
6.
避免**污染。尤其在以
YPDA
培养时,酵母培养物易于受**污染。可以通过培养物气味、生长速度和培养物沉降系数简易鉴别。**污染时,培养物带有臭味,而酵母培养物略有酒香味。**生长速度远较酵母为快,一旦发现
OD600
增长过快,应考虑**污染。在
700g
条件下离心
5
分钟,酵母可以完全沉积于试管底部,液相清亮,若液相仍混浊,发生**污染的可能性大。
7.
避免霉菌污染。制备新鲜平板要晾干后保存。所有平板(新鲜的、在培养箱中培养的以及在冰箱中保种的)均应以
parafilm
密封。
酵母转化
8.
酵母转化时,使用的溶液应预先平衡到室温。
9.
接种的初始种子数要足量,过夜培养物
OD600
应达到
1.5
,转接大瓶后才能较快生长。
10.
从液体培养物中收集酵母*好使用水平转子,因为酵母菌体离心后并不能十分紧密的附着于管壁,角转子离心后产物附着面积大,易于剥离。水平转子离心后沉淀与液相接触面积小,弃去液相时不易受侵扰。
11.
转化文库时,热激过程中应使用玻璃容器,所盛液体体积不超过容量的
1/5
。玻璃较之塑料易于传热,温度上升快。液体体积不超过容量的
1/5
,保证液体内部温度差异较小,也保证热激后培养过程中有足够的通气。操作过程中应同时取等体积的水盛于另一相同的玻璃容器中,同时置于水浴,以温度计检测等体积的水温度的上升情况,直至水温上升至
42
度,方可开始计时。
滤纸显色反应
12.
滤纸显色反应中要使用液氮,应注意**。
13.
AH109
菌株显色反应结果不稳定,该菌株携带的半乳糖苷酶基因启动子起始转录效率低,较弱的蛋白间相互作用难于完成高效的半乳糖苷酶合成,显色不明显。
14.
滤纸显色反应应在酵母生长饱满后再行操作。饱满菌体可明显隆起于平板表面。菌体太少时黏附于滤纸的菌体也会少,显色效果不佳。
转自生命科学论坛
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