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Southern杂交技术基本原理-仪器结构|技术参数|功能特点|规格

Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
　　(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
　　(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
　　(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
　　(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
　　Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
　　将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。
　　1、材料：待检测的DNA，已标记好的探针。
　　2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。
　　3、试剂：
　　(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。
　　(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,过滤**后于-20℃储存。
　　(3)1×BLOTTO:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。
　　(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。
　　(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。
　　(6)0.2mol/L HCl。
　　(7)0.1% SDS。
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