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Northern杂交技术基本原理-仪器结构|技术参数|功能特点|规格

Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
　　1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。
　　2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
　　3、试剂：
　　(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。
　　(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。
　　4、操作步骤：
　　(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
　　(2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。
　　(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。
　　(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
　　(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。
　　(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。
　　(7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
　　[注意]
　　(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解。

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