DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 （primer），因为它只能以引子所的3'-OH为起始点进行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。 一般实验常以人工合成的寡核苷酸为引子进行DNA聚合反应，这时固然可以根据已知序列设计核酸引子，但也可以采用逢机引子（random primers）。 所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用广者是以自动化机器所合成的、六到八个核苷酸长的寡核苷酸混合物；反应进行中若有任何一条逢机引子结合到模版DNA，即可引导DNA聚合反应的进行。 以random priming方法进行核酸标定，是以逢机引子引导Klenow fragment（large fragment of E. coli DNA polymerase I）进行DNA聚合反应，并在反应过程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。 而为了避免random priming也发生于载体部份的DNA，好不要直接以质体DNA为模版进行标定反应，而应预先将目标DNA自载体切除出来。 仪器用具：微量离心机；沸水浴及冰浴 药品试剂： 模版DNA （pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段，将由助教） 0.2 M EDTA, pH 8.0 4 M LiCl Random priming kit （Roche）： Hexanucleotide mix （random primer） dNTP mixture （1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP, pH 7.5） Klenow enzyme （2 U/μL） 酒精 70%酒精 TE （10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA） 方法步骤： ◆ 以下反应条件与步骤主要参照random priming kit 制造厂商所的产品说明书。 1） 取100 ng 模版DNA,加入适量去离子水，把体积补足为15 μL. 2） 于沸水中加热10 min. ◆ 请记得以夹子固定微量离心管的管盖部份，以免离心管在加热过程中盖子爆开、进水！ 3） 加热后，迅速把微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。 4） 离心数秒后，依序加入下列三种试剂： 2 μL hexanucleotide mix 2 μL dNTP mixture 1 μL Klenow enzyme 5） 以指头轻弹离心管，以便混合均匀。 6） 短暂离心后，置于37℃恒温水槽中作用2 h. ◆ 反应时间至少须要1 h,长可反应过夜。 7） 作用完毕的后，加入2 μL 的0.2 M EDTA,以便终止DNA 聚合反应。 8） 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL纯酒精，混合均匀，置 -20℃过夜。 隔天： 1） 于13,000 rpm,4℃离心15 min. 2） 倒出上清液，加入50 μL 的70%酒精，再离心5 min. 3） 倒出上清液并风干DNA. 4） 后以50 μL TE 溶解DNA. 华东生物器材网（www.jp1718.com）是上海金鹏旗下网站。本网是专业的生化器材网站，集生产、制造、销售于一体。优势产品有紫外分析仪、核酸蛋白检测仪、凝胶成像分析系统、低压液相色谱分离仪、自动部分收集器、梯度混合器、旋转蒸发器等生物仪器，是销售生化器材品种**，规模庞大的专业企业。 上海金鹏分析仪器有限公司 www.jp1718.com 电话： 61425398 36162366 手机： QQ:964122960，765695826， 842727501， 2460311703， 2431022418，170324176 传真： 地址：上海市真陈路1398弄15号 邮编：200444