钙是参与真核生理学的*普遍的离子之一，参与从骨发育到信号转导的重要过程，细胞内钙调节的紊乱可导致严重的神经和结构并发症。由于其重要性，钙在细胞水平上研究是一个相对较大的主题。为了可视化和量化细胞内钙，研究人员采用荧光钙指示剂（或染料），可以螯合自由漂浮的钙离子，以产生定量的荧光反应。当与荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪配对时，钙指示剂可用于成像和监测细胞内钙浓度。
荧光钙指示剂可以是基因或化学工程。遗传指标涉及在活细胞或动物中转染或表达GFP变体，而化学指示剂由基于BAPTA的小分子组成，其对钙离子具有高选择性。在这两大类钙指标中，化学指标主要受到青睐，因为它们的商业可用性，便利性和实验设计的灵活性。
目前选择的化学指标中有相当受欢迎的单波长钙指示剂，无论它们是否与钙结合，它们只会发出一种颜色的荧光。传统的绿色荧光钙指标包括Fluo-3及其改良版Fluo-4。Fluo-4是由Gee及其同事在2000年开发的。它本身基本上是一种非荧光底物，但一旦与钙结合，其荧光增加了100倍。其成像技术使研究人员能够发现钙信号传导中的许多相互作用，*近，它已被广泛应用于基于细胞的HTS分析中，用于**发现。Fluo-4是Fluo-3的类似物，其中两个氯原子被氟原子取代，
尽管Fluo-3进行了轻微的结构修改，但Fluo-4在产生更明亮和更敏感的信号方面取得了巨大进步，使Fluo-4成为共聚焦显微镜，流式细胞仪和微孔板筛选应用的理想选择。Fluo-4的细胞渗透型Fluo-4 AM是一种流行的绿色荧光钙指示剂，不需要对背景噪音进行淬灭。
即使荧光增加了100倍，Fluo-4 AM在一些领域也不乏问题。遇到的一个常见问题是由于电池泄漏导致的低信号背景比。为了解决这个问题，Fluo系列的大多数指标将与一种试剂配对，该试剂可防止荧光反应离开细胞或溶解渗漏以减少背景信号。这些试剂的实例包括丙磺舒或磺胺吡喃酮抑制细胞膜中的阴离子转运蛋白，以防止钙的任何通过。常见的相容性表面活性剂是Pluronic®多元醇，有助于将染料溶解在水溶液中。然而，这些物质的应用使细胞环境受到更多侵入性操作，并且可能影响整体细胞完整性或钙活性。为避免使用额外的试剂，可选择Cal-520 AM。绿色染料Cal-520经过优化，可解决染料损失问题及其改善的细胞内保留，因此不需要额外的试剂来保持钙含量或抑制背景。CAL-520 在与Fluo-3和Fluo-4类似的光谱下实现更高的灵敏度和信号背景比。
除染料损失外，使用Fluo-4的另一个缺点是保持其使用所需的苛刻的细胞负载条件。另一种绿色染料Fluo-8可以在室温下装载细胞，而不是Fluo-3和Fluo-4所需的37摄氏度。由于Fluo-8的性能不依赖于温度，因此它是HTS应用的理想选择。Fluo-8也以不同的解离常数（更高和更低）制备亲和力）和包装尺寸，包括HTS就绪尺寸。*后但同样重要的是，Fluo-8发出的信号比Fluo-4强两倍。与Cal-520一样，Fluo-8与Fluo-4具有非常相似的激发和发射峰，同时是进行绿色荧光成像的更容易获得的通用选择。
化学钙指示剂的另一个麻烦的方面是它们在细胞内分隔的倾向。一种表现出这种现象的染料是Rhod-2 AM，一种流行的红钙指示剂。它的净正电荷促使许多类型的细胞中的线粒体被隔离。Rhod-2在线粒体中的这种定位在其引入细胞后不久发生，导致活细胞内的荧光信号有限。Cal-590被设计为保留在细胞的胞质溶胶中，而不是其线粒体，液泡或其他细胞器，同时保留Rhod-2的光谱波长。Cal-590适用于红色染料成像的**细胞成像。还有右旋糖酐形式钙指示剂可用于区室化和细胞内染料保留中更有效的测量。向染料分子中加入大分子葡聚糖允许高溶解度同时保持低毒性，这使其在与染料缀合时作为区室化或渗漏的预防是上乘的。选择使用葡聚糖时产生的唯壹缺点是它必须通过贴片移液管或显微注射注入细胞。
除了增强的荧光和改善的细胞质保留外，Cal系列染料（Cal-520，Cal-590和Cal-630）具有用于多重检测或多色检测的光谱质量。Cal-520的激发*大值保持在492，比其他绿色染料的激发*大值更接近氩激光488 nm。这种接近488 nm的特性使Cal-520可与任何荧光仪器平台兼容。激发*大值分别为573和608 nm，发射分别为588和626 nm，红色Cal-590和Cal-630的长波长使它们与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系以及FITC兼容 和AlexaFluor 488标记的抗体。