1) 根据机器配置选择*亮的荧光染料
了解你使用的流式细胞仪的性能，大多数流式细胞仪有两个或者多个激光器，有五种波长可供选择：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）。除了激光器，具体的虑光片和检测器也决定了你的配置可同时检测多少种颜色。
多色标记荧光染料尽量选用不同激光激发的染料。荧光染料在同一激光激发的染料中选择时，优先选择亮度高的染料，以保证*佳分辨率。常用的高亮度染料有PE、PE/Cy5、PE/Cy7、APC、PerCP/Cy5.5、AlexaFlour 647等，但是并不是说染料亮度高，在您的流式细胞仪上就能获得较好的信号，这还需要您的仪器的配备合适的激光、滤光片和探测器。
2) 平衡抗原表达水平和染料荧光亮度
在单色流式检测实验中，我们通常会选择亮度*强的几种染料，如PE、APC等等。但是，在多色流式检测时，有时因为颜色的限制不得不用到一些亮度较暗的染料。为了保证每个通道的分辨率可接受，我们需要合理搭配抗原和染料。一般来说，较暗的染料，如FITC、PerCP等，优先分配给表达量高的抗原，而PE、APC、PerCP/Cy5.5、PE/Cy5等较亮的染料可以分配给表达量低或者分辨率要求比较高的抗原。合理配色的*终结果是让不同表达水平的抗原检测到的信号尽量均衡。
3) 保证搭配荧光染料的质检发射光谱重叠度尽量小
如前所述，当两种荧光染料的发射光谱重叠时，它们的荧光信号将会互相干扰，给数据分析带来麻烦。虽然荧光补偿技术可以将干扰扣除，但补偿值越大，补偿后的信号分辨率会降低越厉害。*好选择很少或者没有重叠的荧光基团，以*大限度减少这种渗漏。不同激光激发的染料是优选，如PE和APC，但在某些情况下，这可能与尽量选择亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析时，经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cy5与APC均可被红色激光（640nm）所激发，而两者的发送光谱也比较接近，导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调整。相反，由于PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm，不能被红色激光器所激发，也就不存在Cy5.5对APC的干扰，所以用PE-Cy5.5对APC计划没有串色。因此，可能需要牺牲个别荧光染料的亮度来避免荧光渗漏以及分辨率下降。
4) 尽量避免偶联荧光染料使用带来的假阳性
随着颜色的数量不断增加，实验中可能会用到串联荧光染料。串联荧光染料是指通过共价键方式将两种染料串联，其中一种染料的发射光谱与另外一种染料的激发光谱部分重叠，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。串联荧光染料很容易降解，重新分解为原来的两个染料，从而出现对应两个通道的假阳性，若使用串联的荧光染料，务必要在短时间内尽快完成实验，曝光时间越长，荧光染料就越不稳定。在固定和透化的过程中，偶联荧光染料的亮度可能降低，因此操作步骤应当尽可能温和。