TF/TQ染料标记MMP和酪蛋白的肽序列及结果
材料和方法
所有肽均采用美国肽公司标准FMOC化学合成。一些TF肽是用FMOC-Lys（TF）-OH、FMOC-Asp（TF）-OH或FMOC-Glu（TF）-OH氨基酸制备的。在肽的标记中，用TF-NHS酯标记赖氨酸残基的N端氨基或ε-氨基。用TF马来酰亚胺或碘代乙酰胺标记巯基半胱氨酸残基。
TF1，TF2，TF3，TF4，TF5，TF6，TF7和TF8的酸、马来酰亚胺和NHS酯形式，以及FMOC-Lys（TF2-Boc）-OH，FMOC-Lys（TF3）-OH，FMOC-Asp（TF3）-OH，FMOC-Glu（TF3）-OH等均可从百萤生物获得。
所有的酶分析都是用从Sigma，R＆D Systems，EMD Chemicals购买的纯化酶完成的。使用用日立U-3010拍摄了吸收光谱，终点荧光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax（分子设备）上进行，酶动力学分析在FlexStation分子设备上进行）。
Tide Fluor （TF）染料的光谱特性
我们的TF系列荧光标记染料覆盖了整个可见光谱，具有非常高的标记效率。例如，TF2的光谱特性与AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理条件下或细胞内，它比荧光素亮3倍，耐光性高4倍。TF染料具有对pH4～pH10的pH波动不敏感的荧光，而FAM和FITC的荧光强度在同一范围内强烈依赖于pH值。
|
TF 染料
|
Ex(nm)
|
Em(nm)
|
可替代
|
|
TF1
|
353 nm
|
442 nm
|
AF350, AMCA, EDANS
|
|
TF2
|
498 nm
|
520 nm
|
AF488; DL488, FITC, FAM, Cy2
|
|
TF3
|
560 nm
|
575 nm
|
AF546, AF555, Cy3, DL549, TAMRA
|
|
TF4
|
585 nm
|
605 nm
|
AF594, DL594, Texas Red®, ROX
|
|
TF5
|
650 nm
|
670 nm
|
AF633, AF647, DL633, DL649, Cy5
|
|
TF6
|
685 nm
|
700 nm
|
AF680, DL680, Cy5.5
|
|
TF7
|
755 nm
|
780 nm
|
AF750, DL750, Cy7
|
|
TF8
|
785 nm
|
800 nm
|
DL800, IRDye CW800
|
使用TF标记的FRET底物检测基质金属蛋白酶（MMP）活性
基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞外基质成分的降解，在细胞凋亡、胚胎发育、生殖组织重塑和修复中起重要作用。 百萤为大家筛选了以下基于TF的FRET底物，以检测MMP活性。
|
#Sub
|
肽序列
|
Ex
|
Em
|
|
1
|
TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(5-FAM)-Ala-Lys-NH2
|
492 nm
|
514 nm
|
|
2
|
TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(TF2)-Ala-Lys-NH2
|
495 nm
|
520 nm
|
|
3
|
TQ3-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF3)-Ala-Lys-NH2
|
560 nm
|
575 nm
|
|
4
|
TQ4-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF4)-Ala-Lys-NH2
|
585 nm
|
605 nm
|
|
5
|
TQ5-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT5)-Ala-Lys-NH2
|
650 nm
|
670 nm
|
|
6
|
TQ6-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT6)-Ala-Lys-NH2
|
685 nm
|
700 nm
|
|
7
|
TQ7-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF7)-Ala-Lys-NH2
|
755 nm
|
780 nm
|
|
8
|
TQ8-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF8)-Ala-Lys-NH2
|
785 nm
|
800 nm
|
MMP活性的检测（续）
图1.以TF为基础的MMP底物与MMP-1（50units/ml）在室温下孵育15分钟。所有基质在5 uM的温度下使用，使用Sub#2的反应速度设定为100%。用上表中分别列出的激发波长和发射波长测量荧光强度。
用TF标记酪蛋白底物检测通用蛋白酶活性
对各种蛋白酶活性的检测已成为许多生物实验室的常规任务。TF染料标记的酪蛋白缀合物被证明是广泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白被TF染料大量标记，导致了荧光猝灭。蛋白酶催化水解减轻了它的淬灭效应，产生荧光性很强的TF染料标记的肽段。TF染料标记肽荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。
|
#Sub
|
肽底物
|
Ex/Em
|
相对Kcat/Km
|
|
1
|
TF1-Casein (~6 Dyes/Casein)
|
492/514 nm
|
98%
|
|
2
|
TF2-Casein (~6 Dyes/Casein)
|
495/520 nm
|
92%
|
|
3
|
TF3-Casein (~6 Dyes/Casein)
|
560/575 nm
|
100%
|
|
4
|
TF4-Casein (~5 Dyes/Casein)
|
585/605 nm
|
73%
|
|
5
|
TF5-Casein (~5 Dyes/Casein)
|
650/670 nm
|
81%
|
|
6
|
TF6-Casein (~4 Dyes/Casein)
|
685/700 nm
|
76%
|
|
7
|
TF7-Casein (~4 Dyes/Casein)
|
755/780 nm
|
56%
|
|
8
|
TF8-Casein (~4 Dyes/Casein)
|
785/800 nm
|
43%
|
图2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解图。 在室温下将3号底物与胰蛋白酶一起孵育。对照孔仅具有蛋白酶底物，而没有胰蛋白酶。 使用FlexStation从时间0（添加胰蛋白酶时）开始检测荧光信号。
百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest*上等的产品、*详尽的技术和*前沿的资讯，欢迎来电咨询！
-
订购电话：
-
邮箱：xiaodong@tjbiolite.com;info@tjbiolite.com
-
QQ：1485814040
-
微信公众号：百萤生物
-
新浪微博：百萤生物-
-
百度贴吧：百萤生物吧
-
丁香通：西安百萤生物科技有限公司
-
生物在线：西安百萤生物科技有限公司
-
搜好货：西安百萤生物科技有限公司
-
爱采购：西安百萤生物科技有限公司