百萤课堂之细胞增殖实验测定（下篇）

三、细胞增殖的染色稀释实验

CFSE和Cyto Tell^TM指示剂是流式细胞术用于检测活细胞增殖的荧光追踪染料。当细胞分列时，荧光染料在自细胞之间均与分布，导致荧光强度随每一代的发展而减半。这些增值染料可以长期用于追踪细胞增殖。

 

应用CFSE进行细胞增殖检测

CFSE（#22022）和RediUse是细胞渗透型绿色荧光增殖指示剂，当被488nm氩离子激光激发时，在517nm出发出荧光信号。两种染料被动的扩散并穿过未受损的细胞膜，由此与细胞内脂酶的酶反应从CFSE切割乙酸基以产生与细胞内蛋白质共价结合的胺反应性羧基荧光素SE。虽然CFSE仍然被广泛用作在498nm激发下的绿色荧光增殖指示剂，但它绝非无条件。CFSE对细胞具有局毒性，容易发生染料泄露，并且会溢出到PE和PE-Texas红通道中。

 

细胞增殖指标

        Cyto Tell^TM 染料是一系列细胞渗透型荧光示踪剂，旨在监测活细胞的细胞增殖，而不存在任何缺点的CFSE。细胞膜被动扩散后，CytoTell^TM 染料被细胞内酯酶水解以产生高度荧光的胺反应性或硫醇反应性染料，其不可逆地与细胞内蛋白质上的胺或硫醇基团结合。细胞毒性很小，经过几代的分裂，染料在细胞内保留得很好。使用 CytoTell^TM UltraGreen (22240)可视化多达9代。CytoTell^TM 染料有7种不同的荧光发射 颜色，在多色分析中提供更大的灵活性。他们可以固定和渗透，以分析细胞内目标使用标准甲醛含固定剂和皂甙为基础的渗透缓冲液。

图1.CytoTell^TMGreen和CFSE检测细胞增殖。在第0天将 Jurkat 细胞(- 2x106个细胞/mL)用 CytoTell^TM Green 或 CFSE 染色。然后在指定的日期以1:1的比例连续传递细胞。用 ACEA NovoCyte 3000流式细胞仪测定通过当天 FITC 通道的荧光强度。不同的颜色峰代表连续几代。

表1.用于流式细胞仪的 CytoTell^TM 和 CFSE 细胞增殖染料

四．细胞增殖分析

       ATP 存在于所有代谢活跃的细胞中，在死细胞中几乎不存在，是鉴定活细胞的合适的生物标志物。ATP 的定量分析已被用于确定哺乳动物细胞中的细胞增殖和细胞毒性，并用于检测水、土壤和血液等样品中的低水平污染。虽然可以使用多种检测方法，但由于其较高的灵敏度，研究人员通常选择基于荧光素-荧光素酶生物发光的 ATP 分析来测量细胞增殖。PhosphoWorksTM发光 ATP 测定试剂盒提供了一种简单和均匀的方法来测量 ATP 使用萤火虫萤光素酶及其底物萤光素。在 Mg2 + 存在下，萤火虫萤光素酶催化萤光素、 ATP 和 O2的反应，产生约560nm 的光，可以用光度计检测到。存在的 ATP 浓度与样品中活细胞的数量成正比。也可以使用 PhosphoWorksTM 比色 ATP 测定试剂盒(21617)和 PhosphoWorksTM 荧光 ATP 测定试剂盒(21620) ，其可以分别在100μL 反应体积中检测约3μM 或约0.4 μM 的 ATP。

图2.使用 NOVOstar 读板器(BMG Labtech)在96孔板上使用 PhosphoWorks^TM 发光 ATP 测定试剂盒 * DTT-Free * 测量 Jurkat 细胞。这个试剂盒可以检测到低至100个细胞。积分时间为1秒。

表2.测定细胞增殖的ATP实验