Q7.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?
非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量,或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)+(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.
NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base
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Molecular Weight
|
A
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313.21
|
C
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289.18
|
G
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329.21
|
T
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304.19
|
I
|
314.2
|
U
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290.17
|
常规修饰基团分子量
5’-Biotin
|
405.45
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3’-TAMARA
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623.60
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5’-(6 FAM)
|
537.46
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3’-Dabsyl
|
498.49
|
5’-HEX
|
744.13
|
3’-(6 FAM)
|
569.46
|
5’-TET
|
675.24
|
3’-Amino Modifier C3
|
153.07
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5’-Cy5
|
533.63
|
3’-Amino Modifier C7
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209.18
|
5’-Cy3
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507.59
|
3’-Thiol Modifier C3
|
154.12
|
Q8.如何溶解引物?
干燥后的引物质地非常疏松,开盖前*好瞬时离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。
Q9.如何保存引物?
引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。
干 粉:运输时常温运输,-20℃可以保存一年。
储存液:配好后分装成几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。
工作液:常规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。
修饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。
Q10.*长可以合成多长的引物?
我们合成过100base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80base。引物越长,出现问题的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗产品,全长引物的百分比不高,后续处理还有丢失很多,*后的产量很低。
Q11.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?
主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,*后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格也高。
Q12.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?
连接反应需要引物的5'磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。
Q13.为什么引物的OD260/OD280小于1.5?
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
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Base Composition
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A260/280
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5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3
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2.50
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5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3
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1.85
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5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3
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1.15
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5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
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1.14
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5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
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1.66
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