Q1. cDNA产量的很低 可能的原因: *RNA模板质量低 *对mRNA浓度估计过高 *反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 *同位素磷32过期 *反应体积过大,不应超过50μl
Q2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 **常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系 *与反应起始时RNA的总量及纯度有关 *建议在试验中加入对照RNA ***链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10 *建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于**链合成。由于RNA模板存在二级结构,如环状结果,有可能导致GSP无法与模板退火;或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。 *目的mRNA中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决: a. 将**链的反应温度提高至50℃。 b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行**链反应。
Q3. 产生非特异性条带 *用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用DNase I重新处理样品。 *在PCR反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火,降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。 *由于mRNA剪切方式的不同,根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
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