1. 两片段连接
通常是指目的片断和载体片断的连接,包括①小片段(目的片断小于载体片断的大小)和载体片段的连接,这种情况多些,也比较容易连接,按照说明书要求的比例进行即可,比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector连接时Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为1 :2~10即可,如果效果不佳,检测一下感受态细胞,如果片断过小比如几十bp,连接时要加大小片段的摩尔数,多连几管,挑选白斑,以上是指双酶切后的连接,即载体和目的片断俩端的酶切位点相同;②大片段(目的片断与载体片断的大小差不多甚至大于载体的大小)和载体片段的连接,目的片断与载体片断的大小差不多的情况应尽量避免,因为这会给目的片断胶回收带来麻烦,我就遇到过这种情况,胶回收时很是费尽,*后勉强分开,当然换个载体也许就解决问题了。我做过3000多bp和pMD19-T Simple Vector的连接,开始不行,后来成功了,连接率不高,我的经验是如果感受态细胞没问题,那就反复试目的片断和载体片断的连接比例,可以超出此范围1 :2~10一试。
2. 多片断的连接
做多个片断的连接,首先强调一个问题,那就是一定要注意所有片断俩端的酶,把他们的特征要弄得清清楚楚,是否存在同尾酶和同裂酶,多片段同时连接时这个问题就太重要了;多片段连接要总体先规划好了,再开始入手设计引物,否则考虑不周后患无穷啊! ①多片断的连接*经常的做法是顺次俩俩连接(目的片断和载体片断的连接),就采用载体上的多克隆位点,注意顺序!如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近,甚至相邻,*好分步酶切载体,比双酶切效果好的多,经验!接下来的方法和前面的差不多,就是麻烦些 ②多片断的同时连接,我*多做过四个片断的同时的连接,当然,其中包括载体片断。做多个片断的同时连接,不得不把我走过的弯路告诉大家!那就是同尾酶的问题,我也是在合成引物后发现的这个问题,我的其中一个片断俩端分别是XhoI和SalI,结果问题来了,酶切后连接时有可能正连也可能反向连接,如果连正了还好,反了就比较郁闷了,根据当时的实验设计,如果想改就得改所有其他片段的引物,硬着头皮来吧!筛吧!一个原则,小片段要量大,多设计几种比例,连吧,挑选白斑,做菌落PCR检测连接情况,想想觉得痛苦,每个板挑几十个白斑做鉴定,大部分假阳性,不过*后还是找到了正确连接的克隆,可是浪费了很多时间和**,惨痛的教训!感觉多片断的连接,关键还是片断之间的摩尔比,大胆尝试吧!
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。本公司由海外华侨和多名海归博士组成的技术团队,主要致力于**学、分子生物学、病理学、代谢组学、生物化学技术在科研中的应用与推广,专业从事医学科研课题外包,项目申请、组织实施、检查评估、验收鉴定等服务。有着十分丰富的科研经验和实战技术,所以值得选择,以上信息仅供参考,详情请致电相关工作人员为您解答。
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