目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多,我们在这一部分中除了介绍常规的DNA提取方法外,还将着重讨论由微量样品(如毛发)提取DNA 的一些新方法。 1.提取动物总DNA 的常规方法 从动物组织中提取DNA 的常规步骤如下: (1)取动物组织100mg 左右于样品管中,用干净的剪刀将组织块剪碎。 (2)在样品管中加入如下试剂: 500μl STE 溶液 25 μl 蛋白酶 K(Proteinase K,10 mg/ml) 75μl 10% SDS (3)混匀后置56℃下消化2 小时以上(隔一定时间混匀一次)。 (4)加人等体积的饱和酚溶液,轻轻颠倒混合5 分钟以上(用于rDNA 和RAPD 分析的样品需抽提24 小时)。 (5)7 000r/min 离心5 分钟。 (6)小心将上层清液移至另一干净的离心管中,加入等体积的苯酚及氯仿,并重复步骤(4)和(5)的抽提过程。 (7)以等体积的氯仿(内含1/25 体积的异戊醇)重复步骤(4)和(5)的抽提过程。 (8)在上清液中加入 1/10 体积的 3mol/dm3NaAc 或 5mol/dm3NH4Ac、2 倍体积的冷无水乙醇或1 倍体积的异丙醇,以沉淀DNA。 (9)置—70℃下沉淀2 小时或置—20℃下沉淀过夜。 (10)7 000r/min 离心10 分钟,再以 70%冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。 (11)以适量的TE 溶液(200~500μl)溶解DNA 样品。 (12)以分光光度计测定DNA 的浓度(260nm),260/280nm 的光密度比值应在 1.8 以上,否则提示可能有蛋白质或苯酚的污染。 (13)以TE 溶液将DNA 样品稀释成所需的工作液的浓度。 (14)取2μl 左右的样品进行电泳检测,以判断 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。
2.微量动物组织样品的总DNA 提取方法 从微量组织中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam(Walsh 等1991)发展起来的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100(一种螯合剂)提取DNA。此方法简便、快速,提取后的DNA 样品可以直接作为PCR 的模板。具体的操作步骤如下: (1)取一小块冰冻的组织(少于1mg,可用经**的枪头钻取),或1~3 根带有毛根的毛发(需先经 90%、70%的乙醇和**水依次清洗,并剪去毛干部分),或 1~5μl 血液,加入经过高温**的离心管中。离心管内事先加入 500μl 5%的Chelex 溶液。 (2)将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间,直至组织样品成粉末状(不同组织所需时间各不相同)。 (3)在振荡器上振荡10~15 秒钟。 (4)在 95~100℃下煮 15~40 分钟。 (5)在振荡器上振荡10~15 秒钟。 (6)将样品管在4℃下保存,进行PCR 反应之前再次离心,使Chelex 颗粒沉淀。取上清液(1~10μl)作为DNA 模板。
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