可能的原因
建议
抗体浓度太高
1.一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度
使用的封闭液不兼容
1.对比不同的封闭缓冲液
非特异性位点封闭不足
1.优化封闭缓冲液,*好的封闭缓冲液具有系统依赖性
2.提高封闭液中蛋白的浓度
3.优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜
4.在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%
封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应
1.换一种不同的封闭液
2.不要用含***蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素
3.交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测
洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积
1.降低HRP结合物的浓度
2.如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%
膜的曝光时间过久
1.缩短印迹膜曝光到胶片的时间
2.按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的
3.用一张新膜
4.保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥
5.在孵育过程中始终进行震荡
6.小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合
7.不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子
缓冲液污染或结块沉淀
1.制备新的缓冲液
1.若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度
HRP处产生聚集体
1.用0.2 μm过滤器过滤结合物
结合可产生斑点
1.用一种新的高质量的结合物
缓冲液中有污染
1.使用新的缓冲液
2.缓冲液使用前过滤
操作设备被污染
1.保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物
2.保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景
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