可能的原因
建议
蛋白未转到膜上
1.转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。(注:总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。)
2.确保转膜过程中胶与膜完全接触。
3.确保转印夹层排布正确
4.确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜
5.确保转印部件在电印迹过程中未过热
6.使用正对照和/或分子量Marker
7.优化转印时间和电流
8.确保样品制备条件优于蛋白印迹,为破坏样品的抗原性。(注意:许多蛋白不能在还原状态下进行)
蛋白未完全结合到膜上
1.在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。
抗体不足
1.增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小
2.抗体可能失活,可用斑点印迹检测其活性。
抗体浓度太高
1.使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失,呈现出很弱的信号。
抗原不足
1.加入更多的蛋白进行跑胶
2.抗原被封闭液掩蔽
3.试用不同的封闭液
4.优化封闭液中蛋白浓度
缓冲液中含有叠氮钠
1.叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂
曝光时间太短
1.延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时)
底物孵育时间太短
1.在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。
底物失活
1.超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月,超感应**膜化学发光底物可保存至少6个月
2.为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的HRP结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或HRP结合物均有可能失活
3.确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降
膜可以修复剥离重新用探针检测
1.在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性
2.优化剥离程序
3.如有必要可重新用探针检测
4.避免在同一张膜上重复进行探针检测
在膜上消解抗原
1.封闭底物可能含有蛋白水解酶活性(如明胶)
印迹膜保存时蛋白降解
1.准备一张新的印迹膜
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