广义上来说,凡是细胞培养体系中的外来成分或成分变化,都应视为污染,细胞污染不能完全被消除,但能减少其发生的频率及后果的严重性,细胞污染主要根据细胞污染源主要可以分为物理性、化学性、生物性污染。
01霉菌污染
种类很多,污染的多是曲霉菌,白色***,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物,一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝,并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。***及酵母菌菌株呈卵圆形,散在细胞上及细胞周边生长。处理:确认是霉菌污染,如果细胞种类不是特别的珍贵,直接放弃,并将实验环节彻底**。万不得已,可以尝试抗霉菌素如两性霉素B来清楚污染,实际操作中效果很难保证。
02**污染
**污染较常见的有大肠杆菌,白色葡萄球菌,假单孢菌等。加用**素的培养液可预防和排除个别一般少量**的污染。一旦发生**污染很容易发现,多数情况下培养液短时间内变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显浑浊现象;有时静置的培养液起初不混,但稍加震荡,就有许多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮,有时在细胞表面及周围有大量**存在,细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确**种类;有的培养液改变不明显而有疑似污染,亦可向肉汤培养基内地入少量培养液,37度培养以检测。处理:一般用***的常用量的5~10倍作冲击疗法,用药24~48小时后再换常规培养液,有时在早期污染时此法有效。
03支原体污染
支原体是一种大小介于**和病毒之间(*小直径0.2um)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般***不敏感。支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解,因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可做荧光染色法:用能与DNA特异性结合的荧光染料,可使支原体内含有的DNA着色,染色后用荧光显微镜观察。处理:市场上有多种支原体**的试剂盒,效果比较好。
04细胞交叉污染
细胞污染和**污染不同,细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行,而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在,但使培养细胞不同种类之间发生混乱,细胞生长特性,形态发生变化。污染过的细胞由于种类不纯,无法进行实验研究。
防治及处理
在进行多个种类细胞培养操作时,所有器具要严格区分,对每一种细胞按顺序进行操作,避免一起操作时造成的混乱;进行换液或传代操作时,滴管或枪头要及时更换,避免把细胞带到培养液瓶中;所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备,一旦怀疑发生交叉污染,可做细胞遗传学方面的鉴定,如发现原有的细胞遗传物发生改变,可以复苏早期冻存的细胞使用。