近年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类**研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想像的那样稳定,诸如基因重排、扩增、缺失,突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生,这些改变对于基因表过和调控,以及**过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是**细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充**细胞化学的发现。从蜡块中提取DNA,结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的组织或细胞,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
1. 操作步骤
(1)准确称取20~25 g蜡块,放入2 ml干净的离心管中;
(2)向其中加入适量的二甲苯剧烈混匀脱蜡,室温下12000 rpm离心2 min,弃上清;
(3)加入适量的无水乙醇充分混匀以洗去残留的二甲苯,室温下12000 rpm离心2 min,弃上清;
(4)可重复步骤2和3,以使脱蜡更充分和二甲苯去除更彻底;
(5)将脱蜡后的组织块放入37℃温箱中10-15 min,直到酒精完全挥发;
(6)加入适量的STE溶液(100 mmol/L Tris-HCL pH8.0、20 mmol/L EDTA、1% SDS)溶解沉淀,如果沉淀难溶解,可以在56℃下温浴促进溶解;
(7)加入20 ul蛋白酶K,充分混匀,在56℃下孵育1-3 h,直至组织块完全溶解,期间不时震荡离心管。室温下12000 rpm离心5 min,取上清;
(8)用酚、氯仿/异丙醇抽提,无水乙醇洗涤沉淀,12000 rpm离心5 min;
(9)尽量弃尽上清,风干使乙醇挥发干净,加入适量的ddH2O溶解DNA,置于-20℃冰箱保存备用。
2. 影响DNA提取质量的因素
(1)固定剂对DNA的影响
固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲液福尔马林固定的标本,DNA保存完好,可以获得高分子量DNA。
DNA提取过程中的蛋白产K消化,酚/氯仿抽提和纯化等步骤,可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。乙醇被认为是保存核酸的*佳固定剂。
(2)固定时间对DNA的影响
固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解,虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的,但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。不同标本对不同固定剂所需的*佳固定时间应模索选定。常规组织固定应在12 h以上至110 h之内DNA提取效果较好。