因为能够正确地折叠及翻译后修饰,CHO细胞被广泛用于构建表达单克隆抗体的稳定细胞株。通过载体构建、细胞株构建、培养基优化和工艺优化来提高单抗的产量。抗体的关键质量指标如糖基化、电荷异构体、聚体的水平以及序列变异体等会影响其**性和有效性。由于稳定细胞株的构建到后期工艺开发是一个不可逆的过程,所以我们应该在早期阶段对关键质量指标进行监控,以避免可能造成的项目开发进度延误,同时确保开发**有效的抗体**。
序列变异体的产生主要是DNA突变引起的,特别是在DHFR筛选系统中,由于某种核苷酸的耗尽或是对理化压力(如MTX)的应激反应。序列变异可能会造成单抗中某种氨基酸被替代而改变其**结构,甚至改变其**结构,而变异后的单抗也很难确定其**原性和有效性。而后期的纯化工艺通常很难讲序列变异体**,因此我们需要在细胞构建的各个阶段鉴定并排除含有序列变异体细胞株。传统方法中,人们通常将重链和轻链的mRNAs反转录成cDNAs使用Sanger测序法进行测序,使用LC/MS检测单抗的分子质量来发现序列变异体,但其精度和灵敏度并不是很高。本文中将细胞构建的各个过程中得到的Pool、克隆和亚克隆使用RNAseq进行测序来发现序列突变体,并将生产得到的单抗通过LC/MS和肽谱图分析对序列变异体进行确认。
本文选用DHFR缺陷型CHO细胞转染表达IgG1的抗体,细胞构建和Fed-batch过程中均使用CD培养基。培养条件是36.8°C, 5% CO2, 湿度95%,在摇瓶中培养时转速为140rpm。
细胞株构建
1.细胞株的构建主要包括以下几个步骤:
a.独立进行多个转染;
b.逐步进行加压:先将MTX浓度加到100nM,再次将MTX浓度提升到500nM,并选择产量较高的Pool进行克隆筛选;
c.克隆筛选:通过有限稀释法将细胞接种到96孔板中,2~3周后,挑选**超过50%的细胞进行Elisa检测,挑选出产量高的克隆;
d.将克隆扩大培养并将MTX浓度逐步增加到*高6µM,然后以0.3 cells/well接种到96孔板中进行亚克隆。
在细胞株构建的各个阶段分别选取产量高的Pool或者克隆,共计11个,对其进行RNAseq测序。如下图所示:
2.各阶段Pool和克隆Fed-batch产量的比较
在克隆筛选的各个阶段都进行Fed-batch评估,以0.5×10e6 cells/mL接种,初始培养条件为140rpm、36.8°C、 5% CO2和度95%。在Day3、5、7、9和11分别流加初始体积的3%、5%、7%、10%和10%,每天取样检测糖、乳酸和产量,并根据糖的消耗流加糖。在进行克隆和亚克隆评估时,还在第5天进行了降温(31°C)。*终产量如下图所示
从上图可以看出,克隆或亚克隆的产量都比Pool高出许多,除了克隆过程本身可以筛选出表达量更高的细胞株外,培养工艺过程中的降温也有一定帮助。其中79-8-30虽然QP比其母克隆79-8有所提升,但是*终产量并不相上下。
使用RNAseq测序识别低水平的序列突变
对11个被选的高产Pool或细胞株进行RNAseq测序,发现这 11个Pool或细胞株中有3个包含序列变异体,如下表所示:
Cell line
|
HC/LC
|
cDNA
Position (bp)
|
Level (%)
|
Mutation
Description
|
Corresponding
Amino Acid Change
|
11
|
HC
|
407
|
1.64
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C › T
|
S117L
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LC
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132
|
0.43
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A › C
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K24N
|
27
|
HC
|
407
|
1.8
|
C › T
|
S117L
|
79-8-30
|
HC
|
455
|
0.63
|
C › G
|
S133Stop
|
11号Pool的重链407bp处有1.64%的C突变成T,造成丝氨酸(Ser)变成亮氨酸(Leu),轻链的132bp处有0.43%的A突变成C,造成赖氨酸(Lys)变成天冬酰胺(Asn);27号pool的重链407处有1.8%的C突变成T,造成丝氨酸(Ser)变成亮氨酸(Leu);79-8-30亚克隆的重链455bp处有0.63%的C突变成G,造成丝氨酸(Ser)变成为终止子(STOP)。
使用LC/MS对11号和27号细胞表达抗体进行分析
上图A为ESI-QTOF结果,可以发现在Peak 2(HC)附近多出一个小峰,对这个小峰进行分析发现其分子量和理论分子量50,373相差26 Da,刚好为丝氨酸突变成亮氨酸的差异。在27号细胞中也观察到了同样的结果。根据峰面积可以得出突变的重链占比分别为3.4%(11#)和3.1%(27#)。
使用肽谱图分析确认重链117处丝氨酸转变成亮氨酸的突变
将11号细胞株的样品重链进行肽谱图分析,其中重链的99到122片段的质量是2606.24Da,而117处丝氨酸突变成亮氨酸的重链99到122片段的质量是2632.29Da。
上图中A为11号细胞表达抗体中99-122肽段的MS结果,其中包括了氨基酸突变,图B为包含正常Ser的99-122肽段MS结果。如图所示在Y5处质量没有偏移,但从Y6到Y18这之间质量都有26Da的增加,这也正好验证了重链407bp处的C突变到T从而使丝氨酸突变成亮氨酸。
使用RNAseq测序对转染后加压过程中得到的Pool进行检测
电转后的Pool A通过两步增加MTX浓度进行加压筛选得到11、27和36号细胞株,我们将每一步加压后的细胞进行RNAseq测序,鉴定出其序列是否发生变异。
在MTX浓度为100nM时得到Pool中检测到0.22%的重链407bp处C到T的突变,这说明这一突变是在加压的早期就发生了。在MTX浓度提升到500nM时得到的Pool中检测到相同位点的突变为增加到2.6%,说明这一突变点所占比率在压力增加后快速增加。轻链132bp处的A到C的突变点没有在加压过程中检测到,说明这一突变是在MTX浓度加到500nM后出现的。
细胞株构建通常是一个产量导向的过程,但是本实验中得到的11个高产量的细胞株中有3个细胞株出现了序列突变,并且序列变异体生产的抗体跟目的抗体的理化性质很相似,无法通过后期的纯化的进行去除,会影响产品的质量。
转染后的Pool 11和27中存在序列突变体被排除,而Pool79在后续的克隆中没有序列变异体,但是在亚克隆79-8-30细胞株中却存在序列突变点,说明在整个细胞构建的过程中序列突变是随时都会发生的。基因突变可能是自然发生或者是对理化压力的应激,在加压的培养过程中突变会快速的积累。当MTX浓度从100nM提升到500nM时,序列突变的比例升高了10倍;Chen等2012年也报道在MTX加压培养4个月后,序列突变的比例升高了10.5倍。所以在克隆开发的过程中,能有一些快捷简便的方法进行序列突变体的检测至关重要。
本文使用Illumina HiSeq 2000进行RNAseq测序,能够检测到高于0.2%的突变。并且RNA测序可以避免一些假阳性的检测,比直接分析DNA更合理一些。文中通过RNA测序一共发现了3个序列突变点,而在后续实验只验证了重链上的丝氨酸被亮氨酸替代的突变。因为亚克隆79-8-30重链上的C/G的突变是无意突变,丝氨酸(TCA)突变成终止子(TGA)造成HC缩短,引起错误折叠和降解或者在Protein-A纯化时被移除;而轻链上丝氨酸被天冬酰氨替代由于相应肽的电离效率低无法使用质谱进行检测。
在细胞构建的不同阶段进行各种验证和检测能够有效的对序列变异体进行监控,避免*终克隆中包含序列变异体。
一种基于新一代测序技术RNAseq进行克隆筛选的方法如上图所示:
1.对质粒进行DNA测序,避免质粒被污染;
2.电转后进行逐级增加MTX浓度并挑选出高产的Pool,对所得的Pool进行RNA测序,排除包含序列变异体的Pool;
3.在克隆筛选阶段对所得克隆进行RNA测序,并使用质谱分析氨基酸的替代和质量的变化;
4.在工艺优化阶段,要对所得产品使用高分辨质谱进行分析;
5.在构建主细胞库时,使用RNA测序保证序列的正确性,并使用质谱进行确认。
这一方法是基于传统筛选和质量筛选的整合,能够有效的提高细胞构建的效率。
参考文献:
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.