454(GS FLX系统)超高通量测序服务|实验技术服务

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454(GS FLX系统)超高通量测序服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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实验描述               
测序实验流程：
1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）；
Roche <wbr>454（GS <wbr>FLX <wbr>Titanium <wbr>System）超高通量测序技
2、Emulsion  PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
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3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；
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4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
技术特点：
• 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿(400-600M)个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍；
• 读长长，单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右；
• 通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低；
• 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；
• 一致性好，测序结果一致性超过99.99%；
• 可以进行Pair－End测序研究；
• 简便高效，不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在**内完成一个微生物物种的测序工作。
GS FLX系统的应用
全基因组测序
多达120 Mb的未知基因组的测序
－生成基因组结构概图
－研究DNA序列的组织，分布和信息
－基因筛查：寻找新基因，定位和功能
－和其他基因组进行比较研究
全基因组进行测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。
比较基因组研究
－识别单碱基突变
－识别突变热点和保守区域
－识别插入或者缺失的基因
－断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础）
－ 基于基因测序变化进行毒性预测
－进行流行病学分析
－了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础
－进行宏基因组 （metagenomics）研究
－古代化石DNA 测序研究
利用配对末端方法（Pair-End Tag）将Contigs拼接成Scaffolds。
转录组和基因调节研究
基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量转录组分析，或者miRNA 序列的基因组范围识别，小分子和非编码RNA的测序。
研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究。
扩增产物分析
PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序）
－在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变
－在群体水平上发现高可信度的SNP位点