SRB技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
1.SRB检测方法的原理
磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合;在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.5-2.0以下为线性，当超出线形范围时，*好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选。
2.SRB检测的操作步骤
1)细胞固定:药物作用时间终点时，每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。
2)染色:待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。
3)检测:用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。操作中，应注意洗除染料时操作需迅速，避免用移液器吸取液体，防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。
3.SRB检测的计算公式
根据美国国立癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)关于SRB检测的介绍，细胞增殖百分率的计算存在以下两种情况:1)Tx-T0>0，PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)
2)Tx-T0<0，PG=100×(Tx-T0)/T0
其中，
T0:药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值;
C:培养基中加有等体积的DMSO，没有药物作用的阴性对照的平均吸光值(阴性对照);
Tx:药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。
PG即Percentage Growth，是指药物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。
1， 根据水样中 SRB 的估计浓度，可以选择一组合适数目的细菌瓶。首先将培养瓶排成 一组，并依次编上序号。 
2， 将细菌瓶的瓶塞保护膜揭去，并用 70%的乙醇溶液消毒。 
3， 按照准备工作的第 3 条操作后，用无菌注射器取 1ml 水样，注入到一号瓶内，充分 震荡。 
4， 用另一支无菌注射器从一号瓶内取 1ml 水样，注入到二号瓶内，充分震荡。 
5， 再更换一支无菌注射器，从二号瓶内取 1ml 水样，注入到三号瓶内，充分震荡。 
6， 依次类推，一直稀释到*后一瓶为止。根据细菌含量确定稀释瓶数，一般稀释到 7 号瓶。 
7， 把上述测试瓶放入到恒温培养箱中， 培养温度控制在现场水温正负 1℃范围内，两周 后读数。 
实验目的：检测细胞增殖活力或检测样品对细胞体外增殖的影响
实验原理：磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性
关系。
实验材料： SRB（SIGMA），其它同MMT法
实验内容与方法：
1.  细胞计数、稀释细胞悬液，接种96孔细胞培养板，培养；
2.  加入含药培养基，同时设立阴性、溶媒及阳性对照组，培养；
3.  SRB染色，测定；
4.  计数各组别抑制率及应用SPSS 17.0通过Bliss法计算IC50.