Western Blot wb免疫印迹检测课题|实验技术服务

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Western Blot wb免疫印迹检测课题|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的**抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。
1. 组织块称重 
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 
3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 
4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 
5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟 
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 
8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 
9. 沸水浴中3分钟 
10. 上样 
11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 
12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 
13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 
14. Westernblot 试剂盒显色 
15. 分析比较记录 
western blot的实验步骤及注意事项的资料 
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃） 
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 
10． 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 
11． 按步骤9洗涤。 
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。 
注意事项： 
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。