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半定量RT-PCR服务|实验技术服务
日期:2024-09-12 18:15
浏览次数:237
摘要:关键词:半定量RT-PCR服务|实验技术服务
简介:世界****半定量RT-PCR服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
半定量RT-PCR服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。在获得重组蛋白产品的同时,我们也会提供相应的原始数据和原始图片,不需要再额外花费精力重复实验。另一方面,我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:半定量RT-P...
关键词:半定量RT-PCR服务|实验技术服务
简介:世界****半定量RT-PCR服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
半定量RT-PCR服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。在获得重组蛋白产品的同时,我们也会提供相应的原始数据和原始图片,不需要再额外花费精力重复实验。另一方面,我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:半定量RT-PCR服务|实验技术服务 http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
半定量RT-PCR一般是在没有条件做 实时PCR 的情况下使用,用于测定体内目的基因的表达增加减少与否,即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因(如β-actin)的电泳带的相对含量比较,观测目的基因表达增减,另外还要做一个β-actin的内参照对照。
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495µl的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 µl,剩余RNA总量为:
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
3,待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下:
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,*后72℃7分钟延伸。
4, 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
简介:世界****半定量RT-PCR服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
半定量RT-PCR服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。在获得重组蛋白产品的同时,我们也会提供相应的原始数据和原始图片,不需要再额外花费精力重复实验。另一方面,我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:半定量RT-PCR服务|实验技术服务 http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
半定量RT-PCR一般是在没有条件做 实时PCR 的情况下使用,用于测定体内目的基因的表达增加减少与否,即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因(如β-actin)的电泳带的相对含量比较,观测目的基因表达增减,另外还要做一个β-actin的内参照对照。
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495µl的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 µl,剩余RNA总量为:
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
3,待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下:
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,*后72℃7分钟延伸。
4, 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。